Определение билирубина в крови

По данным современных исследований, срок жизни эритроцитов в среднем составляет 110—130 дней. По окончании этого периода они разрушаются в клетках ретикулоэндотелиальной системы костного мозга, печени, селезенки и некоторых других органов. Процессу распада подвергается и содержащийся в эритроцитах гемоглобин.

Вначале происходит разрыв метанового мостика между I и II пиррольными ядрами порфиринового кольца с одновременным окислением двухвалентного железа в трехвалентное. Образующийся таким образом пигмент зеленого цвета получил название вердоглобин (вердогемоглобин, холеглобин, псевдогемоглобин). Дальнейшие превращения приводят к потере вердоглобином железа и глобина, в результате чего порфириновое кольцо разворачивается в цепь и формируется желчный пигмент зеленого цвета — биливердин. Почти весь биливердин ферментативным путем восстанавливается в основной и важнейший красно-желтый пигмент желчи — билирубин, являющийся нормальной составной частью сыворотки крови. Этот свободный (несвязанный) билирубин (линейный тетрапиррол) в силу нерастворимости в воде не переходит в мочу и дает непрямую реакцию ван ден Берга (то есть реагирует с диазореактивом лишь после предварительного растворения в спирте). Следовательно, непрямой билирубин представляет собой свободный билирубин. Последний в клетках печени под влиянием фермента трансферазы связывается с глюкуроновой кислотой, что сообщает ему хорошую растворимость в воде. Благодаря этому связанный билирубин легко выделяется с мочой и реагирует с диазореактивом сразу же после прибавления его к сыворотке желтушных больных. Установлено, что связанный билирубин (прямой) представлен двумя пигментами: монои ди-глюкуронидом; последний составляет 75—80% выделяемого желчью пигмента. Таким образом, билнрубинглюкурониды — это прямой билирубин.

В настоящее время для определения билирубина в сыворотке крови используют:

I. Колориметрические диазометоды, основанные на образовании азобилирубина (красно-розового цвета) при добавлении к сыворотке диазофенилсульфоновой кислоты (и других диазосоединений). К ним относятся: 1. Метод ван ден Берга. 2. Способы с применением акселераторных веществ, обладающих свойством ускорять реакцию между непрямым билирубином и диазореактивом в водной среде путем повышения растворимости свободного билирубина или каталитическим способом. В качестве акселераторов используют: метиловый спирт, кофеин и бензоат натрия, кофеин и мочевину, бен-зоат натрия и мочевину, ацетамид (дифилин), уксусную кислоту.

II. Спектрофотометрические методы, базирующиеся на том, что общий билирубин дает характерную абсорбционную зону при 450— 460 нм.

III. Хроматографические методы.

IV. Способы, основанные на распределении фракций билирубина в различных растворителях.

V. Флюориметрические и другие методы.

Большинство колориметрических способов определения билирубина базируется на реакции ван ден Берга. Она протекает в две стадии. Вначале под воздействием соляной кислоты разрывается тетрапирроловая цепь и образуются два дипиррола. Затем два ди-пирроловых производных диазотируются диазофенилсульфоновой кислотой с превращением их в азобилирубин.

Оригинальным методом ван ден Берга устанавливают лишь характер реакции (прямая, непрямая, замедленная), то есть отмечают преобладание в сыворотке крови того или иного билирубина.

Метод Иендрашика, Клеггорна и Грофа дает возможность фрак-ционно устанавливать содержание билирубина. Он прост, удобен, не связан с применением дефицитных реактивов и является наиболее приемлемым для практических лабораторий.

Оказалось весьма затруднительно выбрать общий унифицированный метод для исследования всего диапазона наблюдаемых в норме и при патологии концентраций билирубина. Для определения билирубина в плазме новорожденных наиболее приемлем способ Маллоя и Эвелина в модификации Лате и Рутвена, поскольку он оказывается нечувствительным к гемовым пигментам.

Йеидрашик с соавт. указывают, что для исследования билирубина в сыворотке крови существуют нейтральные, щелочные и кислотно-щелочные азометоды. Наиболее чувствительны модификации способа с определением на конечном этапе кислого или щелочного азопигмента. Кислый азозеленый, образующийся при рН 0,8, обладает гораздо более высоким коэффициентом молярной экстинкции по сравнению с таковым розового азопигмента. Однако в кислой среде очень часто наблюдается появление мутности.

Типичный азобилирубин появляется только в слабокислой или в нейтральной среде. В сильнокислой же или щелочной среде ход реакции иной. Поэтому нельзя утверждать, что при щелочном или кислом рН полученный продукт идентичен азобилирубину.

В щелочной среде розовый азопигмент превращается в стабильный продукт зеленого цвета, интенсивность окраски которого измеряется при длине волны 600—610 нм. В этой зоне спектра желтые, красные и коричневые пигменты имеют крайне незначительную абсорбцию, что в большой степени повышает специфичность метода. Иендрашик с соавторами предпочитают щелочной способ кислому также потому, что при его использовании удается избежать осаждения белков. Считается, что во многих случаях весьма удобным является упрощенный нейтральный метод определения билирубина в сыворотке крови с колориметрией при длине волны 530 нм. Однако при этом необходимо учитывать низкую чувствительность диазореакции, которая к тому же может не давать стойких величин абсорбции; при постановке способа очень важно следить за рН среды. Пробы могут давать помутнение (особенно в диапазоне рН 3,5—6,0—кислая среда), зависящее от белков сыворотки.

Разделение билирубина на фракции (ди-, моноглюкурониды) методом хроматографии или с применением органических растворителей позволяет подойти к более глубокой оценке процессов, происходящих в печени. Однако сложность технического исполнения указанных способов затрудняет распространение их в клинической практике.

Определение рекомендуется осуществлять сразу же после забора проб, чтобы избежать окисления билирубина на свету. Гемолиз сыворотки снижает количество билирубина пропорционально присутствию гемоглобина. Следовательно, сыворотка крови не должна быть гемолизирована.

Для избежания ошибки, связанной с появлением мутности, рекомендуется ставить контрольные пробы на каждую сыворотку.

В качестве унифицированного метода для определения билирубина и его фракций в сыворотке крови предложен способ Иендрашика, Клеггорна и Грофа с измерением оптической плотности азопигмента в нейтральной или слабокислой среде при зеленом светофильтре (530 нм).

Методом выбора может служить щелочной способ с измерением оптической плотности зеленого (или синего) азопигмента при красном светофильтре (600—610 нм).

Отечественной промышленностью освоено широкое производство наборов для определения билирубина в сыворотке Крови по методу Йендрашика, Клеггорна, Грофа.

Помимо выбора наиболее приемлемого метода определения билирубина-необходимо было унифицировать и построение калибровочных кривых.

На окраску билирубина оказывает существенное влияние наличие белка в пробе, поэтому все стандартные растворы билирубина должны содержать белок. Правда, в поддержании постоянной концентрации белка нет особой необходимости, поскольку окраска азобилирубина не меняется даже при 50-кратном разведении белка. Цвет азобилирубина в белковых растворах оказывается интенсивнее, чем окраска билирубина в слабых щелочных растворах. Вот почему способы приготовления стандартных проб билирубина на белковых растворах являются наиболее правильными. К ним относится получение билирубинового стандартного раствора в буферированной сыворотке человека по Шеллонгу и Венде.

Очень простой и удобный способ приготовления билирубинового стандарта предложила Комиссия по стандартизации и автоматизации биохимических исследовательских методов Чехословакии.

Построение калибровочной кривой по Шеллонгу и Венде и способом, предложенным Комиссией по стандартизации в ЧССР, приводится при изложении метода колориметрического определения билирубина и его фракций.

Наиболее высокой чувствительностью обладает флюориметрический способ исследования билирубина.