Результаты и обсуждение

Получение и характеристика препаратов ФС-2

Для изучения карбоангидразоподобной активности белков PsbPи PsbQсначала необходимо выделить функционально активные препараты ФС-2. Их функциональная активность является мерой целостности этого пигмент-белкового комплекса. Чем выше фотосинтетическая активность полученных ФС-2, тем более полный выход белков PsbP и PsbQ можно получить. Поэтому первым этапом работы было выделение препаратов ФС-2 и определение концентрации хлорофилла в них.

Определение концентрации хлорофилла. BBY-препараты ФС-2 были получены по методу (RobinsonandYokum, 1980; Bertholdetal., 1981; FordandEvans, 1983). Определение концентрация хлорофилла в выделенных препаратах проводили при помощи спектрофотометрического метода, описанного в «Объектах и методах исследований».

На спектрофотометре (ShimadzuUV-1800)измеряется оптическая плотность (А) раствора при определенной длине волны 654 нм (данные приведены в табл.2).

Табл. 2. Измерение оптической плотности хлорофилла.

Расчет концентрации хлорофилла производился по формуле, описанной в методике, результаты приведены в табл.3.

Табл.3. Концентрации хлорофилла для частиц ФС-2 BBYтипа.

Из значений таблицы 3 вычислили среднее значение концентрации хлорофилла 2,628 мг/мл, которое затем использовали при определении количеств препаратов, необходимых для измерения фотосинтетической активности и вычислении объёмов сред для обработки препаратов ФС-2 с целью получения фракции белков PsbP и PsbQ.

Измерение скорости выделения кислорода. Скорость выделения кислорода является наиболее достоверным показателем функциональной активности ФС-2. Измерение проводили при рН 6.5. Концентрациюхлорофилла доводили до 10 мкг/мл. Скорость фотосинтетического выделения кислорода была рассчитана исходя из данныхграфика (рис.6).

Вычисление скорости выделения О2 за 1 час по формуле: V (О2) = ДU*K*60мин/СХл, где ДUзначение изменения вольтажа за 1 минуту, Kкалибровочный коэффициент (мкМО2/мл*мин*В), СХлконцентрация хлорофилла (мг/мл). Значение калибровочного коэффициентавычисляется по специальному калибровочному графику (рис.7). Его значение равно665, 79 мкМО2/ мл*мин*В. За тем по графику (рис.6) нашли изменение напряжения (В) за 1 минуту после включения света (начальная скорость на прямолинейном участке).

Скорость выделения кислорода составила 344,7 ± 12 мкМО2/ ч *мг/мл Рис. 6. График фотосинтетического выделения кислорода ФС-2. Стрелкой вверх показан момент включения света. Стрелка вниз — момент выключения света

Для этого метода получения BBYмаксимальное значение для выделения кислорода показано порядка 600 мкМО2/ч*мг/мл, а среднее значение колеблется в пределах от 300 до 450 мкМО2/ч*мг/мл. Полученные нами данные свидетельствуют о достаточно хорошей функциональной активности ФС-2.

Измерение флуоресценции ФС-2. Ещё одним из наиболее достоверных методов определения функциональной активности ФС-2 является метод измерения флуоресценции. Пигменты фотосинтетического аппарата поглощают энергию света, часть высвечивается обратно в виде флуоресценции или рассеивается в виде тепла. При комнатной температуре в спектре флуоресценции наблюдается преимущественно полоса при 685 нм, принадлежащая антенному хлорофиллу, а ФС-2. (Кизимирко Ю. В., 2006).

Молекула П680, входящая в состав реакционного центра ФС-2, в возбужденном состоянии является первичным донором электрона для акцептора Qa. Реакционный центр находится в открытом состоянии, когда молекула П680 окислена, а хиноновый акцептор Qa восстановлен. После появления первичной пары П680+Феопроисходит восстановление П680+ от вторичных доноров. В результате РЦ оказывается состоянии П680Qa, называемое закрытым (Goh, Schreiber, Hedrich et al., 1999; Renger, 1992). Эти состояния характеризуются разным выходом флуоресценции (в закрытом состоянии флуоресценция максимальна, а в открытом — минимальна).

Разность между максимальным и минимальным выходом флуоресценции называется переменной флуоресценцией. Было установлено, что под действием света происходит восстановление первичного акцептора QA и выход флуоресценции возрастает от начального уровня (Fo) до максимального уровня (Fm), т. е. возникает так называемая переменная флуоресценция (Fv = Fm — Fo).Эта величина пропорциональна той части энергии света, которая используется в фотохимических реакциях фотосинтеза при открытых реакционных центрах ФС-2 и теряется в виде флуоресценции и тепла при закрытых реакционных центрах. Для расчета данных, полученных в ходе измерения следует брать одно из важнейших соотношений Fv/Fm, т. е. отношение интенсивностей переменной и максимальной флуоресценции. (Ланкин А.В. с соавт., 2014) Это отношение равно квантовому выходу использования энергии света открытыми РЦ ФС-2. По изменению этой величины можно судить о потенциальной эффективности первичных процессов фотосинтеза в ФС-2. Этот параметр флуоресценции, как показатель состояния и эффективности функционирования фотосинтетического аппарата, широко используется в фундаментальных и прикладных исследованиях. (Antalandal., 1998), (G. H. Krause, E. Weis, 1991).

Измерение флуоресценции проводилось для препаратов изначально адаптированных к темноте. Расчеты были проведены исходя из данных графика флуоресценции (рис.8).

Fmмаксимальный квантовый выход флуоресценции;

Fvзачение переменной флуоресценции;

Foначальный уровень флуоресценции;

Отношение интенсивностей переменной и максимальной флуоресценции составило 0,744. Из других источников известно, что максимальный квантовый выход у листа растения составлял 0,83.(Лукаткин А. С. с соавт., 2009). Таким образом, полученные нами BBY частицы обладают довольно высоким показателем максимального квантового выхода фотохимии ФС-2и этот показатель, в совокупности с данными о фотосинтетическом выделении кислорода этим препаратом, свидетельствует о хорошей функциональной активности образца, достаточной для дальнейшей процедуры выделения белков PsbP и PsbQ.

Электрофорез. Ещё одним методом, позволяющем судить о целостности препаратов является денатурирующий электрофорез. Электрофорез проводили в полиакриламидном геле для идентификации ФС-2. (рис.9). Результаты электрофореза свидетельствуют о наличии в препаратах ФС-2 всех необходимых нам для дальнейшей работы белков.

Исходя из экспериментальных данных о фотохимической активности и электрофореза можно судить о функциональной активности субмембранных препаратов ФС-2 и её целостности, позволяющей проводить с этими препаратами дальнейшие обработки.