Планирование работы с учетом технического устройства лаборатории

Работа с материалом. После забора материала проводится подготовка материала к исследованию. Она имеет ряд этапов.

Фиксация— фрагмент ткани обрабатывают с помощью жидкости-фиксатора. Фиксатором чаще всего применяют формалин, реже — спирты, пикриновая кислота и др. Такая обработка приостанавливает распад клеток и разрушение структуры ткани под действием собственных внутриклеточных процессов (воздействия ферментов клеток и процессов гниения). Таким способом сохраняется прижизненная структура и создается возможность изучение ткани. Действия фиксирующих жидкостей по принципу влияния на быструю гибель клеток и распад белка. Иммерсионная фиксация, наиболее распространенный тип фиксации,. в данном случае фрагмент ткани целиком погружается в раствор; в экспериментальных условиях можно применить перфузионную фиксацию, когда фиксатор вводят через сосудистую систему. В таком случае используют формалин.

Проводка —так называется процесс обезвоживания (дегидратации) фрагмента ткани и пропитки его парафином. На данном этапе обеспечивается уплотнение ткани. Это надо для получения срезов. При слишком мягкой ткани в процессе микротомирования она будет «сминаться», образуя складки, разрывы и другие артефакты, что влияет на непригодность к изучению. Путем последовательного погружения ткани в растворы ксилола и этилового спирта осуществляли традиционно проводку, однако такой метод имеет ряд существенных недостатков. Значительная трудоемкость, длительность (до четырёх суток), испарение реагентов в воздух лаборатории. Это становится опасно для сотрудников лаборатории, ксилолы образуют взрывоопасные паровоздушные смеси, провоцируют острые и хронические поражения кроветворных органов, при контакте с кожей возникают дерматиты. Нестабильное качество получаемой ткани, зависящее от человеческого фактора, в данном случае действий лаборанта. Эта проблема решаема с использования в лаборатории альтернативных реагентов, такие как изопропанол, являющийся нетоксичным, а также внедрение аппаратов — гистопроцессоров, имеющие закрытый контур. Тогда не допускается испарений в воздух лаборатории. Можно значительно уменьшить время проводки по сравнению с ручным методом путем использования гистопроцессоров (до одного часа при использовании гистопроцессора Xpress 120 за счет применения вакуум-инфильтрационной и микроволновой методик).

Заливка — процесс создания блока, достаточно твердого, чтобы быть пригодным для резки (микротомирования). Выполняется фрагмент ткани заливается жидким парафином, целлоидином, пластмассой или специальными средами для заливки. Затем залитую ткань остужают до затвердевания блока. Целлоидин в настоящее время практически не используется; чистый парафин также обладает рядом недостатков, делающих его непригодным для исследования — при его затвердевании образуются кристаллы, уменьшающие его объём на 5—10%, что способствует деформации ткани. При наличии кристаллической структуры он легко крошится при резке. Присадки придают парафину эластичность, что не дает ему крошиться при резке, поэтому чаще всего для изготовления блоков пользуются специальными заливочными средами, представляющими собой смесь парафинов с присадками в виде рисового, пчелиного воска или полимеров. Чтобы создать гомогенную среду для заливки, воск и парафин расплавляют, охлаждают и тщательно перемешивают, повторяя такую процедуру до 5 или 10 раз. Процесс очень трудоемкий, качество получаемой среды нестабильно. Некоторые лаборатории пользуются готовыми средами для заливки, полученными в заводских условиях и не требующих дополнительной обработки.

на специальном приборе — микротоме производится резка, или микротомирование, процесс изготовления тонких срезов. Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии, не должна превышать 4—5 мкм, для электронной — 50—60 нм.

За счет неодинакового химического сродства различных элементов ткани к гистологическим красителям окрашивание срезов позволяет выявить структуру ткани. Например, окраска гематоксилином и эозином позволяет выявить кислые структуры ткани, такие как ДНК и РНК, при связывании их с гематоксилином, имеющим щелочную реакцию, и цитоплазму клеток, которая связывается с эозином. Перед окрашиванием выполняется монтирование среза на предметное стекло. Срез после микротомирования помещают на поверхность подогретой воды для избегания формирования складок, где он расправляется, а потом уже на стекло. Различают традиционное окрашивание и иммуногистохимическое. Окрашивание, как и все остальные стадии процесса изготовления гистологического препарата, может выполняться вручную и автоматически.

Заключение

срезов представляет собой помещение окрашенного среза, монтированного на предметном стекле. Помещается под покровное стекло с использованием среды для заключения. Среда должна иметь коэффициент преломления, близкий к таковому у стекла — канадский бальзам, полистирол, специальные среды для заключения. Хранить заключенный препарат можно достаточно длительное количество времени Исключение составляет использование полистирола — препарат постепенно теряет прозрачность, а сам полистирол трескается. Если в полистирол добавить пластификатор, например, дибутилфталат данные изменения при заключении полистиролом значительно уменьшаются, при таком условии срок годности гистопрепарата увеличивается до 10 лет даже без покровного стекла, в течение 3 лет изменений фактически не происходит.

Основные методы гистологического исследования лишнее убрать Световая микроскопия Фазово-контрастная микроскопия Темнопольная микроскопия Интерференционная микроскопия Поляризационная микроскопия Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия Ультрафиолетовая микроскопия Электронная микроскопия Цитоспектрофотометрия Радиоавтография Иммунноцитохимические методы Метод культуры клеток Микроскопическая хирургия клетки.