Заключение. 
Хромосомная организация геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания

В работе представлен комплекс методов, позволяющих осуществлять детальное изучение хромосомной организации геномов растений, включая надежную идентификацию малоинформативных (небольшие размеры и/или бедность рисунков С-окраски) индивидуальных хромосом. Использование метода выявления рисунков ранней репликации хромосом открывает широкие возможности не только для идентификации хромосом, но и для более глубокого исследования последовательности репликации ДНК у растений. Применение ДНК-интеркаляторов тормозит процесс конденсации митотических хромосом, что приводит к повышению разрешающей способности дифференциального окрашивания и FISH с различными маркерными последовательностями ДНК. Оптимизация программно-аппаратного комплекса регистрации и анализа изображений значительно облегчает, ускоряет и делает более объективными исследования хромосомной организации геномов растений даже с очень мелкими хромосомами. Четкая идентификация индивидуальных хромосом на препаратах, полученных с помощью щадящих структуру ДНК процедур, может служить в качестве кариологической основы при осуществлении проектов тотального секвенирования геномов хозяйственно-ценных мелкохромосомных растений, поскольку открывает возможность получать хромосомои локус-специфические клонотеки с помощью микродиссекции и способствовать созданию генных контигов различной протяженности.

Применение комплексного подхода для одновременного сравнительного исследования кариотипических особенностей и геномного полиморфизма видов льна показало, что на уровне секций результаты, полученные с помощью цитогенетических и молекулярных методов полностью совпадают. На видовом уровне крупные геномные реорганизации, такие как хромосомные перестройки, выявляются методами хромосомного анализа, а мелкие геномные реорганизации — методом RAPD-анализа. Таким образом, с помощью RAPD-анализа можно оценить степень генетической близости родственных геномов, а хромосомный анализ позволяет выявить различия в хромосомной организации геномов, и, следовательно, оба подхода хорошо дополняют, но не заменяют друг друга. Результаты исследования геномов видов секций Linum, Syllinum, Adenolinum, Stellerolinum, Dasylinum и Linopsis важны не только для решения разнообразных проблем эволюционной и сравнительной геномики льна, но и для развития генетических и молекулярных основ селекции льна посевного. Изучение геномов различных видов льновых продолжается, однако уже сейчас можно утверждать, что полученные нами сведения об их кариотипах заложили цитогенетические основы для проведения тотального секвенирования генома L. usitatissimum L. Осуществление этого проекта помогло бы разрешить многие проблемы селекции культурного льна, а также систематики и эволюции видов рода Linum L. на основе новых сведений, которые можно получить методами сравнительной геномики.

Выводы

• 1. Разработан комплекс цитогенетических методов (выявление рисунка ранней репликации хромосом растений, задержка конденсации митотических хромосом с помощью 9-АМА, OR-бэндинг, Q-подобный DAPI-бэндинг и применение новых флуоресцентных лигандов, созданных на базе красителя Hoecht, — DB (8) и DB (17), для получения высококонтрастного флуорохромного бэндинга), и повышающий разрешающую способность анализа хромосомной организации геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания.
• 2. Показано, что FISH-картирование универсальных молекулярных зондов (рДНК, теломерный повтор) не только облегчает идентификацию хромосом и выявление хромосомных перестроек в кариотипах растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком С-бэндинга, но и дает возможность более точно устанавливать взаимотношения родственных геномов. Для растений с небольшими геномами и мелкими хромосомами FISH-картирование геномной ДНК или ее фрагментов из геномных библиотек перспективно для получения дополнительных маркеров, позволяющих проводить успешную идентификацию их хромосом.
• 3. Применение последовательно или одновременно нескольких молекулярно-цитогенетических методов в сочетании с оптимизацией программно-аппаратного комплекса получения и анализа изображений значительно расширяет возможности исследования хромосомной организации геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания.
• 4. По рисункам ранней репликации идентифицированы 13 пар гомологов в геноме A₁ диплоидного хлопчатника G. herbaceum и 26 пар — в геноме (AD)₂ аллотетраплоидного хлопчатника G. barbadense. Хромосомы генома (AD)₂ были разделены на субгеномы A_b и D_b. Сходство рисунков ранней репликации не только в A₁ и A_b геномах, но и в D_b геноме свидетельствует о консервативности последовательности репликации ДНК в родственных геномах.
• 5. С применением 9-АМА впервые проведено морфометрическое исследование хромосом одноклеточных красных водорослей. Показано, что число хромосом может быть использовано для уточнения таксономии класса Cyanidiophyceae (Rhodophyta). Обнаружено, что изученные виды, относящиеся к наиболее примитивным эукариотам, обладают и практически самыми малыми геномами, что демонстрирует зависимость хромосомной организации генома, от его размера.
• 6. Cравнительное исследование хромосом по рисункам Си OR-бэндинга в кариотипах трех сортов ромашки аптечной (M. chamomilla L.) показало, что они различались по полиморфизму С-блоков и не различались по рисункам OR-бэндинга. По сходству рисунков С-окраски хромосом обнаружено, что дикорастущий вид M. inodora является автотетраплоидом, субгеномы которого сходны с геномом M. maritima, который был обозначен M_m. Его сравнение с M_ch-геномом ромашки аптечной выявило сходство морфологии хромосом и рисунков распределения позиций гетерохроматических районов по длине хромосом, что говорит об общности их происхождения.
• 7. По рисункам OR-бэндинга, С/DAPI-бэндинга, распределению на хромосомах рибосомных генов и теломерного повтора, а также их активности, проведено сравнительное исследование кариотипов 8 сортов и 4 линий гороха посевного. RAPD-анализ обнаружил деление их на кластеры в четком соответствии с сортовой принадлежностью. Продемонстрировано, что даже небольшие специфические особенности геномов сортов и линий гороха могут служить основой для их идентификации. C помощью высокоразрешающего DAPI-бэндинга проведено точное картирование разрывов в хромосомах транслокационных линий гороха M-10 и L-108.
• 8. Сравнительное исследование геномов двухромосомных видов злаков Zingeria и Colpodium по молекулярно-цитогенетическим маркерам хромосом и последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров генов 45S рРНК (ITS1 и ITS2) позволило установить, что эти два близких рода имеют монофилетическое происхождение.
• 9. По рисункам С/DAPI-бэндинга и расположения генов рРНК идентифицированы все хромосомы; составлены кариотипы и построены идиограммы хромосом в геномах рода линум L. У видов секции Syllinum впервые охарактеризованы В-хромосомы, что позволило уточнить число А-хромосом (2n=28) в их кариотипах.
• 10. По результатам анализа кариотипов 26 видов льнов из секций Linum Adenolinum, Stellerolinum, Dasylinum, Syllinum и Linopsis рода Linum разделились на 8 групп. Внутри этих групп виды различались по хромосомным перестройкам и плоидности. Результаты RAPD-анализа хорошо согласовались с данными кариологического исследования. Обнаружено, что группы видов льной, имеющие сходную структуру кариотипа, имеют и низкий уровень межгеномной дивергенции и кластеризуются совместно.
• 11. Подтверждена таксономическая обособленность секций Adenolinum, Dasylinum, Linopsis и Tubilinum. Не обнаружено различий видов секций Stellerolinum и Adenolinum. Виды секции Linum разделились на три геномных группы, что позволяет использовать кариотип как дополнительный таксономический признак при уточнении сложного систематического статуса этой секции.
• 12. Молекулярно-кариологическое исследование видов рода Linum L. позволило подтвердить их филогенетические связи. Обнаружено, что секции Linum, Adenolinum и Stellerolinum имеют общего предка. Изучение геномов различных видов льновых продолжается, однако уже сейчас можно утверждать, что полученные нами сведения об их кариотипах заложили цитогенетические основы для начала тотального секвенирования генома L. usitatissimum L.