Болезни, вызываемые РНК-содержащими вирусами

Ретровирусы

Семейство Retroviridae — большая группа вирусов, поражающих все классы позвоночных и некоторых беспозвоночных (дрозофил, ленточных гельминтов). Вирионы ретровирусов представляют собой частицы сферической формы диаметром 80−100нм. Они состоят из сердцевины, внутренней белковой мембраны и наружной липосодержащей оболочки, на поверхности которой имеются выступы длиной до 8нм. В сердцевине различают икосаэдрическую капсулу и нуклеоид. У ретровирусов типа С нуклеоид находится в центре вириона. Геном ретровирусов, в отличие от такового всех других известных вирусов, является диплоидным и представлен двумя идентичными молекулами плюс-РНК, кодирующими у большинства вирусов 4 основных гена. Характерная особенность этих вирусов — наличие в составе вирионов РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы).

По современным представлениям, в семействе Retroviridae выделяют 7 родов, при этом ретровирусы типа С рептилий пока не имеют собственного родового ранга, хотя и отличаются от вирусов С-типа млекопитающих и птиц. За исключением IBD, почти все ретровирусные изоляты у рептилий были выделены из опухолей (Jacobson, 1986). Ретровирусные частицы С-типа были обнаружены в эмбриональной рабдомиосаркоме у маисового полоза Elaphe guttata, (Clark, et al, 1979), в культивированных клетках селезенки гадюки Рассела с миксофибромой (Zeigel and Clark, 1969), у обыкновенного удава с эритролейкозом (Konstantinov, Ippen, 1982), и нескольких пятнистых жарарак Bothrops moojeni с опухолями почек (Hoge, et al, 1995). Несколько не связанных с опухолями ретровирусов было обнаружено в клеточных линиях сердца гадюки Рассела (Clark, 1973), в ядовитой железе жараракуссу и в тканях гаттерии Sphenodon punctatus (Carneiro, 1992), Ретровирусы, включая эндогенные провирусы, постоянно обнаруживают у разных видов рептилий с помощью молекулярных методов (Marschang, et al, 2006). Неклассифицированные провирусы, напоминающие ретровирусы млекопитающих С-типа, были выделены от тигрового и пестрого питонов (Huder, et al, 2002).

IBD (Inclusion Body Disease).

Характеристика возбудителя.

IBD известна уже почти 30 лет; это заболевание поражает удавов и питонов в коллекциях змей по всему миру. Заболевание характеризуется образованием крупных эозинофильных включений в цитоплазме различных клеток эпителиального типа и нейронах ЦНС (Axthelm, 1985, 1989; Schumacher, et al, 1994). При электронной микроскопии пораженных тканей выявляются вирусные частицы с морфологическими характеристиками, схожими с вирионами ретровируса рептилий С-типа. Вирус обладает обратной транскриптазной активностью. Вирус был впервые выделен группой Шумахера в 1994 г. (Schumacher, et al, 1994) и этим коллективом были выполнены постулаты Коха. Однако, впоследствии оригинальный изолят был утерян. Повторно вирус был изолирован группой Якобсона (Jacobson, et al, 1996), но постулаты Коха удалось выполнить лишь частично. И в этом случае, и при инокуляции здоровым змеям других штаммов ретровирусов, выделенных впоследствии, не возникает характерных изменений в клетках, хотя наличие вирусного антигена определяется с помощью ПЦР. При этом введение суспензии зараженных тканей вызывает IBD у здоровых змей (Jacobson, et al, 2004). Интересно, что исследование ультраструктуры включений показывает, что они состоят только из белковых метаболитов, поскольку клетки не имеют дегенеративных изменений, не индуцируют воспалительную реакцию и не содержат инфекционного агента. В дальнейшем было выяснено, что тельца включений в основном состоят антигенно-уникального белка массой 68кД (Wozniak, et al, 2000). В настоящий момент предполагается, что IBD — инфекционное заболевание, вызывающее системное нарушение клеточного метаболизма, по-видимому, индуцированное ретровирусом и имеющее характерные клинические манифестации.

По данным разных авторов IBD встречается в основном у императорского удава B. constrictor imperator, других подвидов B. constrictor, кольчатого удава C. annulatus, а также у некоторых питонов, в основном, у тигровых. Этому противоречат данные Garner Raymond (2004), которые не обнаружили заболевания ни у павших питонов (N=301), ни у анаконд (N=20). В некоторых случаях при характерной клинике IBD и обнаружении ретровируса, в тканях не происходит образования характерных телец включения (Boyer, et al, 2000), в других случаях гистологически поставленный диагноз не был подтвержден результатами ТЭМ. Такие сомнительные случаи IBD описаны у ужеобразных змей L. pyromelana (Jacobson, 1989) и маисовых полозов E. guttata (Fleming, et al, 2003), а также у нескольких видов питонов рода Morelia и пальмовых ботропсов B. marchi (Raymond, et al, 2000). В настоящее время не ясно, являются ли эти заболевания результатом заражения одним или несколькими видами ретровирусов или представляют собой болезни разной этиологии, имеющие сходное клиническое течение.

Клинические признаки и патологоанатомические изменения У заболевших змей отмечают медленно прогрессирующую кахексию, нарушение линьки, координации движений, отрыгивание корма, неврологические расстройства («вертячку», анизохорию, задирание и подергивание головы, опистотонус, неправильное положение колец тела), реже отмечают новообразования (в основном на коже) и лейкозные реакции (до 80−100 тыс/мкл, преимущественно лимфоциты и пролимфоциты), а также вторичные инфекции. Изменения, выявляемые на вскрытии, обычно носят вторичный характер. Отмечают подагру почек, септический тромбоз, гепатоклеточный липидоз или гепатит, меланоз печени, дегенеративные изменения в поджелудочной железе и почках, интерстициальную пневмонию и т. п. Патогномоничным симптомом для удавов и питонов считают воспаление и формирование абсцессов в солитарных железах пищевода, развитых у ложноногих змей (Jacobson, et al, 1999). Эозинофильные включения в цитоплазме можно наблюдать практически в любых клетках и тканях, однако их количество может сильно варьировать. В отдельных случаях при световой микроскопии включения вообще не выявляются. Чаще всего их можно обнаружить в экзокринной части поджелудочной железы (в 100% случаев), в эпителиальной выстилке пищевода и желудка (в 30% случаев). При лейкозных реакциях включения выявляются в цитоплазме приблизительно в 1% периферических лимфоцитов.

Антигенная вариабельность и родство Исследованные ретровирусы позвоночных имеют высокую видоспецифичность, и, поэтому, вполне вероятно, что различные штаммы ретровирусов, выделенные от змей, будут обладать генетическим и антигенным полиморфизмом. Пока, тем не менее, данные о секвенировании вирус-специфических нуклеиновых кислот и сравнительном анализе с известными генами других изолятов ретровирусов в литературе не представлены. Вирусные белки от 3-х изолятов ретровируса RV-1,2,3, выделенных от обыкновенного и мадагаскарского удавов (Jacobson, et al, 1999) показали сходные характеристики при миграции в агарозном геле. Также был исследован специфический 68кД-белок, формирующий тельца включений; к нему были получены моноклональные антитела и проведен блотинг и попытки секвенирования. Однако, сравнение этих данных с другими пробами белков пока не проводили (Jacobson, Bissel, et al, 2004).

Известно, что морфология телец включений при исследовании с помощью ТЭМ может отличаться. Так, включения, обнаруженные у полозов E. guttata, были связаны с мембранами ЭПР, содержали электронноплотный флуктуирующий материал, и размер включений составлял 2−4мкм. Включения, описанные у обыкновенного удава B. constrictor, не были связаны с мембранами, содержали электронноплотные субъединицы, лежащие по периферии включения и были размером 1−4мкм (Fleming, et al, 2003). Другие тельца включений могут содержать мелкие филаменты, электронноплотные субъединицы или гексагональные капсиды. Непонятно, являются ли эти различия результатом полиморфизма вирусных штаммов, особенностей клеточного метаболизма у разных видов змей или речь вообще идет о разных заболеваниях вирусной или невирусной природы.

Экспериментальная инфекция Постулаты Коха для IBD были выполнены группой Schumacher, et al (1994) и затем Jacobson, et al (1996). При инокуляции экспериментальным животным суспензии зараженных тканей формирование включений в гепатоцитах наблюдалось через 15−24 недели.

Эпизоотологические особенности В конце 70-х, начале 80-х годов в США IBD регистрировали преимущественно у молодых, разведенных в неволе тигровых питонов. У этих змей болезнь протекает более остро и неврологические нарушения наблюдают чаще, чем у других видов (Jacobson, et al, 2001). Это может указывать на отсутствие у данного вида иммунокомпетентности к IBD или о низком уровне сероконверсии. В последние 10 лет болезнь чаще всего встречают у обыкновенных и императорских удавов (Lock, Jacobson, 2003). Недавно проведенное исследование на наличие вирусного антигена с помощью nested PCR у диких удавов в Коста-Рике и содержавшихся в коллекциях Германии (N=22), выявило позитивную реакцию практически во всех образцах крови, взятой от удавов, и ее отсутствие в образцах от других видов змей (Marschang, et al, 2006). Это заставляет предположить, что болезнь имеет натуральный природный резервуар в популяции обыкновенных удавов в Южной Америке. Источником являются в основном персистентные носители и клинически больные животные. Распространение происходит, вероятно, с помощью пассивной трансмиссии змеиным клещом O. natricis, контактно, с кормом и водой, а также, возможно, путем вертикальной передачи от родителей эндогенных форм вируса.

Вирусоносительство и выделение вируса Несомненно, что выделение вируса может начинаться задолго до появления клинических симптомов у змей, являющихся источником инфекции. Медленное прогрессирование заболевания, стертость и невыразительность клинических симптомов, делает возможным заражение и от манифестных больных. Без внедрения в практику серологических и других методов прижизненной диагностики заболевания, достоверно оценить эпизоотическую ситуацию по IBD пока невозможно.

Диагностика Диагноз ставят на основании клинических симптомов и обнаружении телец включения в тканях больных животных. Для прижизненной диагностики рекомендуют слепую пункционную биопсию печени или эксцизионную биопсию слизистой из области пищеводных желез и кардии желудка, выполненной с помощью фиброэндоскопа. Можно брать биопсию кожи (на всю толщу кожного лоскута) из нескольких участков. Включения можно изредка обнаружить в миелоцитах и лимфоцитах костного мозга или мазках периферической крови. Однако, в цитологических образцах включения плохо прокрашиваются модификациями Романовского, а клеточный материал быстро разрушается вследствие осмотического шока. Образцы тканей, в которых включения были выявлены с помощью световой микроскопии, следует также исследовать с помощью ТЭМ для уточнения природы включений. Кроме того, желательно исследовать гистологический материал с помощью специальных окрасок на наличие нуклеиновых кислот. Рекомендуется также проводить электрофорез для выявления специфического 68-кД белка, но для этого пригоден только свежий или замороженный материал, не обработанный фиксаторами.

В последние годы были получены антивидовые сыворотки к IgG Boa constrictor на основании которых была разработана и тестирована непрямая ELISA (Lock, Jacobson, 2003) для обнаружения антител к ретровирусу. В качестве вирус-специфического антигена использовали очищенный штамм, выделенный от Boa constrictor с IBD в культуре клеток VH-1 в 2001 г. (Jacobson, et al, 2001). Кроме того, были получены моноклональные антитела к 68кД-белку (Jacobson, Bissel, et al, 2004). Однако, ELISA пока не введена в практику. В Германии используют недавно разработанную nested-PCR на праймерах к вирус-специфической протеазе и обратной транскриптазе (Marschang, et al, 2006).

Эндогенные провирусы у рептилий обнаруживают с помощью ПЦР на субстрате культуры лейкоцитов (Huder, et al, 2002). Тем не менее, посмертное гистологическое исследование пока остается единственным практическим методом диагностики IBD, принятым во всех странах.

Дифференциальная диагностика Клинически IBD необходимо дифференцировать с любыми инфекционными и неинфекционными заболеваниями, вызывающими неврологические нарушения, такими как менингоэнцефалит, полигиповитаминозы В, подагра, интоксикации, инсульт и т. п. При обнаружении включений в цитоплазме или ядрах клеток эпителиального типа или нейронах, необходимо определить природу этих включений. Обнаружение эозинофильных цитоплазматических включений с помощью световой микроскопии не уточняет диагноз IBD. Специальные гистохимические окраски могут помочь в определении нуклеинового материала телец включений, который может свидетельствовать о присутствии вирионов. Окраска метиловым зелёным пиронином используется для выявления РНК. Реакция Фёльгена используется для окраски ДНК, где акридиновый оранжевый окрашивает РНК в красно-желтый, а ДНК в желто-зеленый цвет.

У млекопитающих практически нет заболеваний не вирусной природы, при которых образуются внутриклеточные включения (Cheville, 1983). Исключением можно считать образование телец Маллори, которые состоят из гиалина. Отравление свинцом может быть причиной внутриядерных включений, представляющих собой свинцово — гистонные комплексы.(Cheville, 1983, Coffin, 1996). При вирусном заболевании рептилий могут возникать включения, содержащие вирусные компоненты, такие как капсид, нуклеиновый материал, однако включения без вирусного компонента тоже могут присутствовать при вирусных инфекциях, и не только в случае IBD. Это было продемонстрировано при парамиксовирусной инфекции, когда в цитоплазме эпителия протоков поджелудочной железы гремучников образовывались характерные эозинофильные включения, которые состояли исключительно из гомогенного белкового материала (Jacobson, 1989). Таким образом, если присутствуют включения, должны быть взяты пробы для исследования с помощью специальных окрасок на нуклеиновый материал, электрофорез для определения вирусного белка и сопоставление ультрамикроснимков, полученных с помощью ТЭМ, со структурной морфологией включений.

Терапия Не разработана. Змеи с подтвержденным диагнозом IBD должны подвергаться эвтаназии. Единственное сообщение о попытке применения ингибиторов обратной транскриптазы для рептилий сделал Levine (2002). Автор использовал для терапии обыкновенного удава с лейкемической формой IBD препарат Trizivir (Glaxo, SmithKline), представляющий собой комбинацию трех ингибиторов ревертазы (abacivir, zidovudine и lamivuridine). Доза была рассчитана аллометрически от млекопитающих и составила по компоненту абацивира 5 мг на змею массой 32 кг каждые 72 часа. На фоне терапии нормализовалась картина крови, и змея начала брать корм. К сожалению, удав вскоре пал, и так как вскрытие не проводили, автор не смог сделать окончательного заключения об эффективности этой терапии.

Реовирусы Большая группа вирусов, поражающих позвоночных, насекомых и растения. Вирионы представляют собой неконвертирующиеся икосаэдрические частицы размером 60−80нм, состоят из двойного капсида и сердцевины, содержащей 2-спиральную линейную РНК.

Семейство Reoviridae включает 9 родов.

Характеристика возбудителя Впервые о вирусном эцефалите удавов, возможно, ошибочно, сообщил Axthelm (1989). Наиболее специфическое заболевание, связанное с поражением нижних отделов респираторного тракта, описано у полозов E. mollendorfi и E. taeniura (Lamirande, et al, 1999). При эпизоотической вспышке в группе аризонских королевских змей, L. pyromelana, отмечали поражение тонкого кишечника и печени (Reavill, et al, 2003). Вирус также был выделен от взрослой самки удава, B. constrictor, с характерной клиникой IBD (Schragen, Hetzel, et al, 2004). Эпизоотическую вспышку респираторного заболевания регистрировали в группе мохавских гремучих змей, C. scutulatus (Wellehan, et al, 2005). Кроме того, ретровирусы изолировали от клинически здоровых рептилий, собакоголовых удавов C. caninus; королевских питонов P. regius; полозов E. longissima, зеленого гремучника C. viridis, игуан I. iguana и Ctenozaura sp., зеленой ящерицы L.viridis.

Клинические признаки и патологоанатомические изменения У рептилий реовирусы вызывают острую летальную пневмонию, подострый трахеит, симптомы поражения ЦНС, поражение ЖКТ и печени, в редких случаях изолируются наряду с ретровирусами при IBD у удавов. Прижизненно может отмечаться снижение массы тела, отрыгивание корма, респираторный синдром.

На секции выявляли острую интерстициальную бронхопневмонию, некротизирующий колит или гепатит с образованием многоядерных формаций, серозную атрофию жира. Тельца включений обычно выявляются только с помощью ТЭМ в цитоплазме энтероцитов, гепатоцитов и альвеоцитов.

Антигенная вариабельность и родство Во всех случаях, когда проводилось секвенирование вирурной РНК, вирус был отнесен к роду Orthoreovirus. Вирус охарактеризован как новый, отличающийся генетически от ортореовирусов птиц и млекопитающих.

Экспериментальная инфекция Заражение тонкохвостых полозов E. taeniura изолятом, выделенным от спонтанно инфицированных полозов Меллендорфа E. mollendorfi и частичное выполнение постулатов Коха провели Lamirande, et al (1999). Группа Райчел Маршанг (Schragen, et al, 2004) инокулировала суспензию культуры вируса, выделенного от самки обыкновенного удава B. constrictor с клиникой IBD, 10 новорожденным удавам. Вирусную РНК обнаружили у всех инфицированных змей через 18 недель с помощью ПЦР и выдели вирус в культуре у части животных после эвтаназии.

Диагностика Выделение вируса в культуре клеток сердца гадюки (VH-2), обнаружение вирусных частиц в тканях рептилий спомощью ТЭМ, ПЦР-диагностика (nested PCR) на праймерах к вирусной РНК-зависимой полимеразы ортореовируса млекопитающих и аквареовируса рыб (Wellehan, et al, 2005). Единственный разработанный серологический тест — РН (Marschang, et al, 2002).

Дифференциальная диагностика При поражении легких дифференцируют с парамиксовирозом.

При поражении ЖКТ — с аденовирозом.

При поражении ЦНС — с ретровирозом (IBD).

Терапия При эпизоотических вспышках в группах королевских змей и мохавских гремучников часть животных удалось сохранить, проведя поддерживающую терапию и профилактику вторичной инфекции цефтазидимом.