Измерение транскрипционной активности генов HSP70 с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR)

Тотальную РНК для каждого образца выделяли из 6×106 нейтрофилов с использованием TRIzol-реагента в соответствии с инструкцией производителя. Образцы выделенной РНК подвергали обработке ДНКазой I с целью избавления от возможной примеси тотальной ДНК. Измерение концентрации выделенной РНК (нг/мкл) производили на спектрофотометре NanoVue Plus при длинах волн 260/280 нм (GE Healthcare Life Science, Великобритания). Концентрацию рассчитывали с использованием калибровочной кривой. Процедуру обратной транскрипции для синтеза кДНК проводили с использованием обратной транскриптазы MINT и рандомных гексамерных праймеров по методике, указанной в прилагаемой производителем инструкции. Гексамерные праймеры (12 пмоль) добавляли в смесь объемом 10 мкл, содержащую 2 мкг тотальной РНК. Смесь прогревали в течение 2 мин при 70 °C, а затем переносили в лед на 10 мин. Для инициации реакции синтеза кДНК, реакционную смесь инкубировали при 42 °C и 70 °C в течение 120 и 15 мин, соответственно. Специфические праймеры (5'-3') к отдельным генам белков HSP70 и референсному гену были подобраны с помощью программного обеспечения Primer Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) и программы OligoAnalyzer 3.1. Были выбраны и синтезированы (Евроген, РФ) следующие последовательности (название гена: прямой праймер, обратный праймер). HSPA1: AGGTGCAGGTGAGCTACAAG, CTCGGCGATCTCCTTCATC; HSPA8: TGCTGCTCTTGGATGTCACT, AAGGTCTGTGTCTGCTTGGT;

b-актин:CACCACACCTTCTACAATGAG, GTCTCAAACATGATCTGGGTC.

b-Актин использовали в качестве референс-гена, для нормализации количества кДНК в каждой временной точке измерения.

Специфичность подобранных праймеров проверяли после проведения PCR и электрофореза продуктов PCR в 3% агарозном геле по наличию одного продукта с ожидаемой мол. массой.