Классификация по способу элюции

А. Фронтальный анализ Фронтальный анализ состоит в непрерывном пропускании анализируемой смеси через слой сорбента в колонке. Если анализируемая смесь состоит из двух компонентов, А и В, изотерма сорбции которых линейная, и наиболее слабо сорбирующегося газа Е, то последний заполняет весь объем колонки и покидает ее в чистом виде. При этом на хроматограмме фиксируется горизонтальная линия (нулевая линия) (рис. 15). Если компонент, А сорбируется слабее чем компонент В, то после насыщения сорбента веществом, А из колонки начинает выходить смесь этого вещества с газом Е. На хроматограмме появляется ступень, высота которой соответствует концентрации, А в Е на выходе из колонки. Эта концентрация может быть равна или больше исходной концентрации А. Наконец, когда сорбент насыщается также и веществом В, из колонки начинает выходить смесь газа, содержащая все исходные компоненты, а на хроматограмме появляется вторая ступень, высота которой соответствует суммарной исходной концентрации веществ, А и В.

Так называется вариант хроматографического процесса, когда раствор смеси компонентов непрерывно подается на вход хроматографической колонки. На выходе ее в этом случае появляются один за другим несколько «фронтов» элюата. За первым из них следует чистый, быстрее других мигрирующий в данной системе компонент смеси, отличающийся, очевидно, наименьшим сродством к неподвижной фазе. Второй фронт отмечает добавление к нему следующего по подвижности компонента. За третьим фронтом следует уже смесь трех компонентов, высота которой соответствует суммарной исходной концентрации веществ, А и В. В настоящее время по вполне понятным причинам фронтальный анализ почти вышел из употребления и применяется лишь в отдельных, специальных случаях.

В случае более сложной смеси исходная концентрация всех компонентов достигается после насыщения сорбента всеми ее компонентами. Таким образом, число ступеней на хроматограмме фронтального анализа равно числу сорбирующихся компонентов смеси. Следовательно фронтальный метод позволяет выделить из смеси в чистом виде только одно, наиболее слабо сорбирующееся вещество. Поэтому для аналитических и тем более препаративных целей фронтальный метод применяется лишь в особых случаях. Фронтальный метод используется также для определения физикохимических характеристик вещества, в частности, для определения изотерм сорбции.

Б. Вытеснительная хроматография В этом варианте в колонку или на стартовую линию хроматографической пластинки наносят определенную порцию раствора исходной смеси веществ, а затем ведут элюцию раствором вещества, обладающего заведомо большим сродством к неподвижной фазе хроматографической системы, чем любой из компонентов смеси. Происходит вытеснение их из неподвижной фазы, причем в первую очередь тех, которые обладают меньшим сродством к сорбенту, а затем и всех остальных. Элюент выталкивает все компоненты смеси впереди себя наподобие поршня. Так как они выходят в подвижную фазу концентрированными, то между ними также идет конкуренция за связь с неподвижной фазой. Компоненты, уступающие другим в силе сродства к этой фазе, оттесняются еще вперед, где сорбируются, но только до тех пор, пока их опять не вытеснят компоненты, обладающие большим сродством к сорбенту. В результате такого чередования сорбции и вытеснения компоненты смеси будут выходить из колонки один за другим в порядке возрастания силы их связи с неподвижной фазой. Ясно, что при этом зоны соседних компонентов будут соприкасаться или даже немного перекрываться друг с другом (рис.16).

В отличие от хроматографической элюции, в вытеснительном методе компоненты смеси не разбавляются промывающим веществом, вследствие чего их концентрация не только не уменьшается, но даже увеличивается. Для аналитического фракционирования метод непригоден, но хорош для препаративного или полупромышленного разделения веществ, поскольку емкость колонки здесь используется очень эффективно.

В. Бумажная хроматография Вид хроматографии, основанный на различии в скорости перемещения компонентов анализируемой смеси по бумаге в потоке растворителя (элюента). Хроматограммой в этом случае называют картину расположения хроматографических зон на бумаге после завершения разделения. В бумажной хроматографии используется главным образом специальная хроматографическая бумага, которая должна быть максимально однородной и содержать только целлюлозные волокна. Она может служить неподвижной фазой или инертным носителем неподвижной фазы. В распределительной бумажной хроматографии неподвижная фаза — адсорбированная бумагой вода или неполярные органические растворители, которыми пропитывают бумагу (вариант с обращенными фазами), а элюент — соответственно смеси органических растворителей с водой, часто содержащие также компоненты, комплексообразующие и другие вещества, или водные растворы неорганических кислот и солей. Скорость перемещения компонентов зависит от коэффициента их распределения между фазами и от соотношения объемов этих фаз. В адсорбционной бумажной хроматографии разделение компонентов смеси происходит благодаря различию в их сорбируемости адсорбентом — бумагой. В качестве элюента используются главным образом смеси органических растворителей с водой. В ионообменной бумажной хроматографии используют бумагу, пропитанную ионообменными смолами. Скорость миграции компонентов в этом случае зависит главным образом от констант ионного обмена и рН элюента. Осадочная БХ осуществляется на бумаге, импрегнированной раствором реагента-осадителя, образующего с разделяемыми веществами малорастворимые соединения. Скорость движения компонентов определяется произведениями растворимости этих соединений. В лигандообменной бумажной хроматографии бумагу предварительно обрабатывают растворами ионов металлов, например Сu2+ при разделении аминов и аминокислот. При этом компоненты перемещаются в зависимости от констант устойчивости их комплексных соединений с ионами металлов. На практике часто реализуются одновременно несколько механизмов разделения.

Бумажная хроматография осуществляется в стеклянных хроматографических камерах или других закрытых сосудах. Для улучшения воспроизводимости их часто кондиционируют, покрывая внутренние стенки фильтровальной бумагой, смоченной соответствующим растворителем. В камеру помещают лоток с элюентом, в который опускают край хроматографической бумаги после нанесения на нее пробы разделяемых веществ (обычно объемом 1−10 мкл). Элюент движется под действием капиллярных и гравитационных сил. По расположению бумаги и направлению тока элюента различают восходящую, нисходящую и горизонтальную бумажную хроматографию. Хроматографирование можно проводить также в центробежном поле или в условиях градиента температуры, что увеличивает эффективность и скорость разделения. В так называемой двумерной бумажной хроматографии пробу наносят в один из углов квадратного листа и после завершения хроматографирования в одном элюенте бумагу высушивают и, повернув на 90°, погружают в другой элюент. На двумерной хроматограмме получают до n2 хроматографических зон, где n — число зон, образующихся при обычной (одномерной) бумажной хроматографии. После подъема растворителя на определенную высоту бумагу вынимают из камеры, высушивают и выявляют хроматографические зоны. Если зоны не окрашены, хроматограмму опрыскивают растворами специфических реагентов, образующих с компонентами разделяемой смеси окрашенные или флуоресцирующие соединения. Используют также ферментативные и биологические методы детектирования, например, для выявления ферментов хроматограмму обрабатывают раствором соответствующих субстратов. Радиоактивные вещества обнаруживают, экспонируя хроматограмму на рентгеновскую пленку. Положения хроматографических зон в бумажной хроматографии характеризуют величиной Rf, представляющей собой отношение пути, пройденного центром хроматографической зоны, к пути, пройденному фронтом растворителя: Rf=1/[1 + (KdVs/Vm)], где Кs и Vт — объемы соответственно неподвижной и подвижной фаз, Кd — коэффициент распределения вещества между этими фазами. Погрешность определения Rf около 5%. В стандартизованных условиях эта величина постоянна для каждого вещества и используется для его идентификации. Количественный анализ проводят непосредственно на хроматограммах или после отделения вещества хроматографических зон от целлюлозной основы. В первом случае компоненты определяют с помощью сканирующей денситометрии, флуориметрии, фотометрии или по размеру хроматографических зон, а также активационными методами (при использовании последних двух методов зоны предварительно вырезают). Пределы обнаружения веществ в зонах по окрашенным производным составляют 0,1−10 мкг, флуориметрически -10−3-10−2 мкг, активационным методом — 10−4-10−10 мкг. Отделение компонентов от целлюлозной основы осуществляют экстрагированием, сжиганием бумаги или кипячением ее в смеси кислот. Затем компоненты определяют любым подходящим методом, обычно спектрофотометрическим, титриметрическим или кинетическим. Погрешность количественного анализа не превышает 10%. С помощью бумажной хроматографии можно разделить и анализировать практически все классы химических соединений, в том числе аминокислоты, сахара, стероиды. Кроме того, бумажная хроматография в сочетании с двумерным электрофорезом используется как микропрепаративный метод разделения природных веществ, в частности пептидов. Достоинства бумажной хроматографии: возможность разделения малых количеств (0,001−1 мкг) веществ, высокая чувствительность, простота аппаратуры. Недостаток метода: сильное размывание хроматографических зон, связанное с неоднородностью бумаги. Вследствие этого, для разделения сложных смесей веществ, необходимо использовать листы длиной около 1 м, что приводит к увеличению длительности эксперимента (для двумерной бумажной хроматографии до 15−20 ч) и большому расходу растворителя.