Введение. 
Использование иммобилизованных ферментов в пищевой промышленности

Фермемнты, или энзиммы[1] (от лат. fermentum, греч. жэмз, ?нжхмпн — закваска) — обычно белковые молекулы или молекулы РНК (рибозимы) или их комплексы, ускоряющие (катализирующие) химические реакции в живых системах. Реагенты в реакции, катализируемой ферментами, называются субстратами, а получающиеся вещества — продуктами. Ферменты специфичны к субстратам (АТФаза катализирует расщепление только АТФ, а киназа фосфорилазы фосфорилирует только фосфорилазу). Ферментативная активность может регулироваться активаторами и ингибиторами (активаторы — повышают, ингибиторы — понижают). Белковые ферменты синтезируются на рибосомах, а РНК — в ядре. Термины «фермент» и «энзим» давно используют как синонимы (первый в основном в русской и немецкой научной литературе, второй — в англои франкоязычной). Термин фермент предложен в XVII веке химиком ван Гельмонтом при обсуждении механизмов пищеварения.

История открытия и исследования ферментов весьма интересна и поучительна. Вопросы о том, что же собой представляют живые системы, какова природа процессов в живом, каковы химические основы наблюдаемых превращений вещества, волновали всех великих химиков XIX столетия. Современная химия многим обязана Йенсону Якобу Берцелиусу. Он в рамках атомистической теории Дальтона создал первую таблицу атомных масс, разработал номенклатуру соединений и усовершенствовал химическую символику, создал химический язык, которым мы пользуемся в настоящее время. Й. Берцелиус создал электрохимическую теорию химических реакций, ввел представление об изомерии, открыл ряд новых элементов, таких как церий, селен, торий, ванадий. Им же было введено в химию понятие катализа.

К этому времени уже накопилось много необъяснимых фактов, обнаруживающих влияние «третьего тела» на протекание химической реакции. В 1812 г. Ф. Фогель продемонстрировал, что в присутствии угля происходит реакция водорода и кислорода. В 1817 г. Г. Дэви экспериментально показал, что в присутствии металлической платины или палладия происходит медленное горение водорода, монооксида углерода, метана, паров спирта, эфира. Это были «химические фокусы». Г. Дэви демонстрировал, что при внесении в колбу, содержащую пары спирта или эфира, нагретой платиновой проволоки, часть проволоки, находящаяся в колбе, раскалялась докрасна и «оставалась в таком состоянии, пока в колбе было достаточное количество пара и воздуха». В это время уже были хорошо известны опыты К. Кирхгофа (1811, 1814 г.) по гидролизу крахмала под действием разбавленной серной кислоты и некоего «клейковатого вещества», выделяемого из пшеницы. И. Берцелиус был первым, кто осознал значимость влияния «третьего тела». Он использовал данные опытов К. Кирхгофа при построении своей концепции о катализе. В 1836 г. в статье «Некоторые соображения о до сих пор еще не познанной силе, действующей при образовании органических соединений в живой природе» Й. Берцелиус писал: «Сущность „каталитической силы“ состоит в том, что тело лишь своим присутствием, а не благодаря химическому сродству, не проявляющемуся при этой температуре, может возбуждать дремлющие химические сродства взаимодействующих веществ». С самого начала развития представлений о катализе было ясно, что в биологических системах ускорение реакций под действием катализаторов играет первостепенную роль. Й. Берцелиус писал: «В живых растениях и животных, в тканях и жидкостях протекают тысячи каталитических процессов, осуществляя большое количество различных химических синтезов из общего исходного материала». Это была гениальная догадка. Из школьной характеристики И. Берцелиуса: «У мальчика хорошие способности, но плохое поведение. Его будущее сомнительно». В современном смысле понятие «катализ» вошло в химию лишь спустя полвека после смерти Й. Берцелиуса благодаря работам Вильгельма Оствальда. Были сформулированы основные понятия о скорости химических реакций, установлены зависимости скорости реакции от концентраций взаимодействующих веществ (Якоб Вант-Гофф (1852—1911) «Очерки по химической динамике» (1884 г.), Нобелевская премия по химии 1901 г. за открытие законов химической кинетики и осмотического давления), прежде чем понятие о катализе прочно вошло в категорию фундаментальных представлений химии. В. Оствальд определил катализатор как вещество, «которое, не входя в конечный продукт химической реакции, увеличивает ее скорость». Соответственно катализ представляет собой «ускорение медленно протекающих химических процессов в присутствии посторонних веществ». В 1901 г. В. Оствальд писал, что он различает четыре типа катализаторов: контактное действие «зародышей», гомогенный катализ, гетерогенный катализ и действие ферментов. В 1909 г. В. Оствальду была присуждена Нобелевская премия по химии за работы по катализу и основополагающие исследования скоростей химических реакций. Таким образом, основоположники теории катализа изначально рассматривали ферментативный катализ как неотъемлемую составную часть катализа в целом. Представления о том, что катализ в живых системах осуществляют химические вещества, также имеют свою историю. Впервые каталитическое действие биоматериала было обнаружено Константином Сигизмундовичем Кирхгофом (1764—1833). К. Кирхгоф (аптекарь и химик по образованию) занимался проблемой получения сахара из крахмала. В это время он работал в главной аптеке Санкт-Петербурга. К. Кирхгоф понимал, что сахар и крахмал являются химически родственными соединениями. В 1811 г. он представил в Академию наук образцы сахарного сиропа и кристаллического «сахара», полученные им путем гидролиза картофельного крахмала под действием разбавленной серной кислоты. Реакция протекала сутки, при этом серная кислота не расходовалась и по завершении процесса нейтрализовалась расчетным количеством карбоната кальция. Это был истинно каталитический процесс. В 1812 г. К. Кирхгофом были изложены основы этого процесса в статье «О приготовлении сахара из крахмала». Расширяя свои исследования, К. Кирхгоф обнаружил, что аналогичного результата можно добиться и без добавления кислоты, а под действием «клейковатого вещества» (клейковины), которое он получил из пшеничного зерна. 30 ноября 1814 г. К. Кирхгоф выступил с докладом «О получении сахара при осолаживании злаков».

Впервые было показано, что агентом, обеспечивающим гидролиз, является отличное от крахмала «клейковатое вещество». Работая в России, К. Кирхгоф провел большое число исследований в области технической химии. В 1812 г. он был избран экстраординарным академиком Петербургской академии наук, был членом Падуанской и Бостонской академий. Все великие химики первой половины XIX в. участвовали в дискуссии о природе процессов, происходящих в живых системах. В качестве модели и главного объекта анализа и дискуссии рассматривался процесс конверсии сахара в спирт или уксусную кислоту (винное или уксуснокислое брожение). Парижская академия наук в 1799 г. задала конкурсный вопрос: «Чем отличаются растительные и животные вещества, действующие как фермент, от тех веществ, которые подвергаются ферментации». Обоснованный ответ на этот вопрос был дан французским исследователем Шарлем Каньяр-Латуром (Ш. Каньяр де ла Тур) (1777—1859). Он экспериментально показал, что дрожжи, осуществляющие ферментацию, — не просто химические вещества, а живые организмы, способные расти и размножаться, причем исходные вещества и продукты реакции — простые химические соединения. Этот вывод был встречен в штыки Й. Берцелиусом, Ю. Либихом, Ф. Вёлером. Вклад Юстуса фон Либиха в развитие органической химии и агрохимии сравним лишь со значением работ Й. Берцелиуса для общей и неорганической химии. Ю. Либихом создана теория радикалов, разработаны методы анализа и впервые осуществлен синтез многих органических соединений, показана роль фосфора и азота в развитии растений, впервые использованы минеральные удобрения — суперфосфат и сульфат аммония для повышения плодородия почв. Великий Ю. Либих в школе имел много проблем. Он увлекался химией и пренебрегал традиционными школьными предметами. Отец устроил его практикантом в аптеку. Но Юстус больше интересовался химическими экспериментами, чем производством лекарств. Опасные опыты с серебром и ртутью он проводил тайно. Опыты закончились сильным взрывом, взлетела на воздух крыша аптеки. На этом карьера Либиха-аптекаря закончилась. Фридрих Вёлер (1800— 1882) знаменит, прежде всего, своими работами по получению мочевины и щавелевой кислоты (простейших органических соединений) из неорганических веществ. Им также впервые получен в значительных количествах металлический алюминий, открыта практически важная реакция получения ацетилена из карбида кальция. Ф. Вёлер так описал лабораторию И. Берцелиуса, в которой были сделаны выдающиеся научные открытия: «Рядом с жилым помещением находились две очень скромно оборудованные комнаты. Там не было газа и воды. В одной комнате стоял обычный деревянный стол, у стены — несколько маленьких шкафов с небольшим количеством реагентов. Канализационную систему заменяли сосуд с водой, фаянсовая раковина и стоящие внизу ведра. Во второй комнате находились весы и другие инструменты и мастерская с маленьким токарным станком. На кухне выполняла свои служебные обязанности Анна, которая была служанкой и лаборанткой великого ученого. Там же стояла маленькая печь и постоянно горячая песочная баня». При этом И. Берцелиус утверждал, что хороший химик должен уметь просверлить отверстия пилой. Й. Берцелиус, Ю. Либих и Ф. Вёлер представляли себе процесс брожения как истинный химический процесс, в котором осадок (дрожжи) обладает некоторой химической активностью. Фактически вопрос сводится к тому, что же представляет собой катализатор: химическое вещество неизвестной, возможно, очень сложной структуры или живой микроорганизм? Ю. Либих, Й. Берцелиус, Ф. Вёлер и многие другие химики не могли воспринять идею о том, что живые организмы при брожении осуществляют химическую реакцию, несмотря на то, что поток фактов, подтверждающих это, непрерывно рос. Бурная дискуссия о природе химических реакций в живом развернулась между JI. Пастером, Ю. Либихом и М.Бертло. Луи Пастер был ярым сторонником того, что брожение (т.е. конверсию сахара в спирт или в уксусную кислоту и сопутствующие продукты) могут осуществить лишь живые клетки микроорганизмов. Л. Пастер отвергал саму идею необходимости существования растворимых ферментов, участвующих в брожении. Он писал: «Я не вижу никакой необходимости ни в существовании этих ферментов, ни в полезности их функционирования при брожении». Отметим, что Ю. Либих, проводя различные химические реакции с органическими молекулами, не мог допустить мысли, что для реализации простого химического процесса — окисления спирта в уксусную кислоту (реакция идет под действием различных химических окислителей) — необходимо участие такого сложного агрегата, как целая клетка живого микроба. Ю. Либих предполагал, что наблюдается всего лишь корреляция между «физиологическим процессом» образования продуктов и ростом клеток. Значительную роль в выяснении вопроса сыграла дискуссия между Л. Пастером и Марселеном Бертло. Работы М. Бертло внесли громадный вклад в развитие синтетической органической химии. Им были осуществлены реакции получения уксусной и муравьиной кислот, проведен синтез этанола из этилена, синтез жиров из глицерина и карбоновых кислот, синтез бензола из ацетилена, созданы основы газовой электрохимии и проведен синтез ацетилена в электрическом разряде. М. Бертло полагал, что процесс брожения осуществляется органической субстанцией дрожжей. Важным был эксперимент М. Бертло, в котором он разрушил клетки дрожжей, получил бесклеточный экстракт, переосадил его спиртом без существенной потери активности и доказал, что полученная субстанция обладает каталитическими свойствами. Этот эксперимент показал, что «фермент» и живые клетки микроорганизмов не одно и то же, продемонстрировал, что клетки содержат вещества, реально осуществляющие химическую реакцию. На то, что брожение имеет характер каталитического процесса, указывал Эйхальд Митчерлих. В 1843 г. он отмечал, что для проведения процесса сбраживания сахара необходимо незначительное количество дрожжей (менее 1%), несоизмеримое с количеством конвертированного субстрата, т. е. вкладом дрожжей как вещества в материальный баланс реакции можно пренебречь. Дискуссия закончилась, но участники остались при своем мнении.

Необходимо отметить: авторитет JI. Пастера был настолько высок, что его мнение, что лишь живые клетки микроорганизмов являются носителями процессов конверсии вещества, господствовало среди микробиологов длительное время. Его влияние на исследователей ощущалось и в XX в. Эйхальд Митчерлих (1794−1863) Особую роль в дискуссии сыграла неоднозначность в терминах, существовавшая в те годы. В течение многих лет дрожжи называли ферментом. Л. Пастер был против распространения термина «фермент» на растворимые вещества, способные проводить конверсию сахара, а понимал под «ферментом» живые растущие клетки, осуществляющие образование этиленового спирта и СО2. Термины «энзим» и «энзимология» были введены в 1876 г. В. Кюном для обозначения «неорганизованных», «бесформенных» ферментов, таких как диастаза, пепсин, трипсин, известных уже тогда. Точку в этом историческом споре поставили опыты Э. Бухнера (1897 г.), который продемонстрировал возможность проведения процесса брожения под действием бесклеточных экстрактов. Э. Бухнер механически разрушал клетки дрожжей, наблюдая за процессом под микроскопом, проводил экстракцию водой с отделением жидкости от твердых частиц фильтрованием под высоким давлением. Полученный раствор смеси ферментов был способен к интенсивному выделению спирта и СО2 при введении его в раствор сахарозы. На реакцию не действовали классические антисептики. Опыты показали, что брожение — результат действия ферментов, не зависящего от целостности клетки. В 1907 г. Э. Бухнеру была присуждена Нобелевская премия по химии. Результатом работы большой группы исследователей, начиная с К. Кирхгофа, И. Берцелиуса, заканчивая В. Оствальдом и Э. Бухнером, явилось утверждение, что ферменты — это химические катализаторы и необходимо искать объяснения действия ферментов на химической основе. Таким образом, стало ясно следующее. Химический катализ и биологический катализ — это явления одного порядка; катализаторы («третье тело») обладают общим свойством — они способны ускорять химические реакции. При этом существуют как общие катализаторы, способные ускорять многие реакции (например, кислоты), так и специфические катализаторы, ускоряющие лишь узкий круг реакций и работающие с ограниченным набором субстратов. Последнее свойство характерно для ферментов. В клетках микроорганизмов, растений, животных, человека имеются вещества, обладающие исключительно высокой каталитической активностью. Биологические катализаторы способны ускорять как простейшие химические реакции (инверсию сахара, гидролиз белков, реакции окисления), так и сложные процессы, такие как диспропорционирование сахара в этанол и СО2. Важным результатом была демонстрация того факта, что биокаталитической функцией обладают белки. Наиболее четко это было сформулировано немецким исследователем М. Траубе. В 1858 г. он в рамках своего представления о действии ферментов охарактеризовал ферменты как химические вещества белковой природы. Этому предшествовал этап накопления экспериментальных фактов. В 1830 г. П. Робике и А. Бутрон-Шаляр исследовали гидролиз аминдалина под действием измельченного горького миндаля. В 1831 г. Э. Лейксом было обнаружено, что слюна обладает активностью диастазы. Впервые достаточно очищенный препарат фермента удалось получить А. Пайену и Ж. Персу в 1833 г. Они выделили амилазу из солода, осадив ферментный препарат спиртом. Аналогичными методами удалось получить ферментный препарат синигриназы (Ж. Форс, 1835 г.), пепсина (Т. Шванн, 1836 г.), трипсина (Л. Корвизар, 1857 г.). Заметную роль в развитии методологии выделения ферментов сыграли работы Э. Брюкке и А. Я. Данилевского, которые использовали явление адсорбции для разделения белков. В 1862 г. А. Я. Данилевскому впервые удалось разделить трипсин и панкреатическую амилазу. Эти работы стали основой современных методов получения белков.

Следующий этап исследования ферментов связан с осознанием того факта, что ферменты обладают способностью взаимодействовать лишь с избранными субстратами, т. е. обладают специфичностью. Также было доказано, что субстрат в процессе каталитической реакции образует лабильный комплекс с белком. Детальное исследование ряда систем позволило Эмилю Фишеру сформулировать представления о специфичности ферментативного катализа. Э. Фишер — выдающийся химик-органик. Он занимался изучением природы белков, сахаров, красителей, азотистых оснований, дубильных веществ. Э. Фишер гидролитически расщепил белки и показал, что все белки построены из аминокислот. Ряд аминокислот он получил встречным синтезом. Э. Фишер синтезировал дипептиды и олигопептиды. В 1907 г. им синтезирован пептид, состоящий из восемнадцати различных аминокислот. В 1894 г. Э. Фишер начал цикл работ по изучению специфичности действия ферментов. Эти работы были продолжением его исследований структуры сахаров и пептидов. Для объяснения специфичности действия ферментов Э. Фишер сформулировал положение о том, что субстрат подходит к ферменту, как ключ к замку. Это положение не потеряло актуальности и сегодня лежит в основе представлений о стерическом соответствии между субстратом и ферментом. Выдающиеся работы были выполнены Э. Фишером в области химии углеводов и красителей. Работы Э. Фишера заложили основы изучения нуклеиновых кислот. За исследования сахаров и пуриновых производных в 1902 г. Э. Фишер был удостоен Нобелевской премии по химии. То, что фермент взаимодействует с субстратом и образует фермент-субстратный комплекс, следовало из анализа кинетики каталитической реакции. Изучение кинетических закономерностей действия ферментов начиналось на этапе развития химической кинетики. Впервые скорость ферментативных реакций анализировал Г. Тамман. Он провел тщательное сравнительное исследование действия ферментов и химических катализаторов реакции гидролиза и показал, что ферментативный гидролиз гликозидов и дисахаридов аналогичен классическому кислотному, исследуемому со времен К. Кирхгофа. Г. Тамман впервые изучил температурные зависимости скорости ферментативной реакции. Результаты работы были опубликованы в 1892 г. в журнале русского физико-химического общества и впоследствии в журнале физической химии, издаваемом Я. Вант-Гоффом и В. Оствальдом. Завершенную форму химико-кинетические исследования приобрели в работах Луи Анри (1834 — 1913) и Леона Михаэлиса. Из кинетических данных однозначно следовало, что в процессе каталитического действия фермент образует комплекс с субстратом. Интерпретация Л. Анри и Л. Михаэлисом роли этого комплекса была различной, однако оба подхода для объяснения экспериментальных данных постулировали образование фермент-субстратного комплекса. Значительный вклад в фундамент кинетики ферментативного катализа внесли работы Э. Армстронга (1904 г.), обнаружившего эффекты ингибирования ферментативных реакций аналогами субстрата, и С. Соренсена (1868 — 1939), продемонстрировавшего зависимость скоростей ферментативных реакций от концентрации ионов водорода.

Впервые высокоочищенный кристаллический фермент (уреаза) был выделен в 1926 году Дж. Самнером. В течение последующих 10 лет было выделено ещё несколько ферментов, и белковая природа ферментов была окончательно доказана. Каталитическая активность РНК впервые была обнаружена в 1980;е годы у пре-рРНК Томасом Чеком, изучавшим сплайсинг РНК у инфузории Tetrahymena thermophila. Рибозимом оказался участок молекулы пре-рРНК Tetrahymena, кодируемый интроном внехромосомного гена рДНК; этот участок осуществлял аутосплайсинг, то есть сам вырезал себя при созревании рРНК. До известной степени эта эволюция ферментов продолжается и сейчас, и мы можем ее проследить, изучая ферментные системы в современных нам высших и низших организмах. Так, например, согласно исследованиям Р. Куна, инвертаза, полученная из различных рас дрожжей, не вполне одинакова по своей активности. Очень интересны также и исследования естественных протеолитических систем низших и высших животных и растений. Эти исследования показывают, что протеазные системы низших являются как бы прототипом аналогичных систем высокоразвитых организмов. Весьма вероятно, что последние системы развились из первых в процессе эволюции. Аналогичные примеры можно найти и из области окислительных ферментов. Однако нужно отметить, что основные формы построения ферментных систем сложились уже на сравнительно ранней стадии, разбираемой нами эволюции в самом начале процесса становления жизни. Поэтому даже у наиболее низко организованных живых существ отдельные ферменты уже представлены в виде довольно совершенных систем. [2].

Цель: рассмотреть специфичность действия ферментов в алкогольной продукции.

Задачи:

• 1. Изучить классификацию ферментов.
• 2. Разобрать строение, функции и химическую природу иммобилизованных ферментов.
• 3. Рассмотреть действие ферментов в производстве алкоголя.