Метод (трехступенчатый). Трансплантация эмбрионов

• 1 ступень: 6,6% глицерин + 10,3% (0,ЗМ) сахароза- 5 минут;
• 2 ступень: 3,3% глицерин + 10,3% (0,ЗМ) сахароза — 5 минут;
• 3 ступень: 10,3% (0,ЗМ) сахароза — 10 минут. Затем эмбрионы промывают в трех порциях среды культивирования.

метод (одноступенчатый)

34,2% (1,ОМ) сахароза — 8 минут.

Затем эмбрионы промывают в среде культивирования.

Процесс удаления криопротектора проводят под микроскопом во избежание потери эмбриона.

После удаления криопротектора оценивают эмбрион по качеству и помещаютего в пайету для пересадки. Время от оттаивания эмбрионадо его пересадки не должно превышать 50 минут.

Заправка эмбрионов в пайеты для пересадок Эмбрионы заправляют в 0,25 см³ пайеты. Заправку осуществляют с помощью пластикового шприца (1 см) или микроаспиратора по следующей схеме (рис. 2): столбик среды культивирования (1 см), столбик воздуха (1 см), столбик среды культивирования (1 см), столбик воздуха (1 см), среда с эмбрионом, столбик воздуха (1 см), столбик среды культивирования (1 см), столбик воздуха (1 см), столбик среды культивирования (1 см). Перенос эмбриона из среды культивирования в пайету производят под небольшим увеличением микроскопа.

Французские пайеты перед заправкой укорачивают, для чего пыж продвигают на 7−8 мм вглубь пайеты и аккуратно острыми ножницами отрезают 4−5мм кончика пайеты со стороны пыжа. Отечественные пайеты закупоривают стеклянным шариком.

После заправки пайеты маркируют. Для этого с помощью фломастера на кончик пайеты со стороны пыжа вдоль ее оси наносят точки и длинные черточки. Одна точка — единица, две — двойка, три — тройка, четыре — четверка, длинная черточка (6−8 мм) — пятерка, длинная черточка и точка — шестерка и т. д. Если пайет больше десяти, то лучше каждый десяток маркировать фломастерами разного цвета.

Подготовка инструмента к пересадкам Пересадка эмбрионов осуществляется с помощью катетера для пересадок, снабженного стерильным одноразовым чехлом. Катетер хранится в цилиндрическом пластиковом футляре, предохраняющем его от загрязнения и механических повреждений.

Непосредственно перед пересадкой пайету с эмбрионом заправляют в катетер, надевают на катетер стерильный одноразовый чехол и фиксируют его стопорной шайбой или замком. Заправленный катетер помещают в санитарный чехол.

Пересадка эмбрионов Животных-реципиентов фиксируют в станке, делают сакральную анестезию 2% раствором новокаина или вводят препарат, расслабляющий маточную мускулатуру (например, «Хане-гиф»). Технолог по пересадкам очищает прямую кишку от фекальных масс, тщательно вытирает сухой бумажной салфеткой наружные половые органы животного, при необходимости их обмывают теплой водой и насухо вытирают. Технолог вводит катетер во влагалище и под ректальным контролем проводит его через шейку в тело матки, направляя в рог, ипсилатеральный яичнику с желтым телом. Убедившись, что катетер введена достаточную глубину (в верхнюю треть рога), технолог, плавно надавливая на поршень катетера, выталкивает жидкость с эмбрионом в полость рога матки и осторожно извлекает катетер из матки.

Подготовка эмбрионов к замораживанию Эмбрионы, пригодные для замораживания (отличного, хорошего и удовлетворительного качества), эквилибрируют в криозащитной среде с глицерином (см. п. 1.6.3.).

Применяют одноступенчатое и многоступенчатое насыщение эмбрионов криопротектором. При отличном качестве эмбрионов используют одноступенчатый метод. При наличии повреждений у эмбрионов предпочтительнее использовать многоступенчатый метод, как более щадящий.

Для приготовления криозащитных сред используют среду культивирования (фосфатно-солевой буфер Дюльбекко с 15% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота или 0,4% бычьего сывороточного альбумина) с добавлением необходимого количества глицерина. Готовят ряд растворов с постепенно увеличивающейся концентрацией глицерина и выдерживают эмбрион в каждом растворе определенноевремя. Последний раствор содержит 1,5 М глицерина. Он являетсякриозащитной средой, в которой замораживают эмбрионы.

Двухступенчатое насыщение. Отобранные для замораживания эмбрионы переносят из среды культивирования в 0,75 М раствор глицерина, а затем помещают в 1,5 М раствор, выдерживая в каждом по Одноступенчатое насыщение Эмбрионы отличного качества из среды культивирования помещают сразу в 1,5 М раствор глицерина и выдерживают в нем 10 минут.

Длязамораживания эмбрионов используют французские или отечественныенайеты емкостью 0,25 см.

Заполняют пайеты так же, как, и для пересадки эмбрионов. После заправки пайеты запаивают. Маркировка пайет может осуществляться различными способами:

• — в пайету со стороны пыжа вставляют цветную пластмассовую пробку, на которой тонким маркером записывают дату извлечения, номер пайеты, номер и кличку донора, код пункта трансплантации, номер и кличку быка;
• — на пайете тонким маркером записывают дату извлечения, номер пайеты, номер и кличку донора, код пункта трансплантации, номер и кличку быка;
• — пайету вставляют в специальный прозрачный пластиковый контейнер и закупоривают металлической пластинкой с выбитым на ней кодовым пятизначным номером, который заносят в специальный регистрационный журнал, где дана его расшифровка, а именно: дата извлечения, кличка донора, стадия развития и опенка качества, а также способ замораживания. В дальнейшем в журнал вносят информацию об использовании эмбриона.

Заполнение, закупоривание и маркировку пайет необходимо закончить за 10 минут, в течение которых эмбрион эквилибрируется в среде с 1,5 М глицерином. Временной интервал от помещения эмбриона в среду с криопротектором до началаохлаждения не должен превышать 30−40 минут.

Замораживание эмбрионов Замораживание эмбрионов в замораживателе ЗЭМ Харьковского СКТБ с ОП ИПКнК Замораживатель ЗЭМ (замораживатель эмбрионов мобильный) состоит из регулирующего блока и камеры. С помощью регулирующего блока можно задать однуиз двух программ автоматического охлаждения камеры.

Программа 1.

• — стабилизация температуры 20°С±2°С;
• — охлаждение со скоростью 1 град/мин от 20 °C до -7°С;
• — стабилизация температуры -7°С (1−2 минуты);
• — охлаждение со скоростью 0,3 град/мин от -7°С до -32°С;
• — стабилизация температуры -32°С (30 минут).

Программа 2.

• — стабилизация температуры 20°С+2°С;
• — охлаждение со скоростью 1 град/мин от 20 °C до 0 °C;
• — стабилизация температуры 0 °C (1−2 минуты);
• — охлаждение со скоростью 0,3 град/мин от 0 °C до -32°С;
• — стабилизация температуры -32°С (30 минут). Перед работой цилиндрическую камеру погружают в сосуд Дьюара Х-34Б или СДС-5. Охлаждение осуществляется автоматически по одной из выбранных программ.

Подготовку замораживателя к работе проводят по прилагаемой к нему инструкции. После заполнения и закупорки пайет их помещают в рабочую камеру замораживателя маркировкой вверх и включают программу охлаждения. По окончании программы замораживания пайеты извлекают из рабочей камеры и быстро переносят в сосуд Дьюара с жидким азотом на хранение. Полный цикл замораживания эмбрионовв ЗЭМе занимает около двух часов.

Замораживание эмбрионов в программируемом замораживателе ЭМБИ-К Замораживатель ЭМБИ-К состоит из камеры и электронного регулирующего блока. Камеру устанавливают на сосуд Дьюара СДС-5. На сдан цикл замораживания расходуется 200−250 г жидкого азота. Температура в камере устанавливается и поддерживается с помощью электронного блока, который управляет работой электромагнитного клапана, регулирующего подачу жидкого азота. Охлаждение эмбрионов происходит в камере, заполненной 96° этиловым спиртом.

Электронный регулирующий блок позволяет задавать различные режимы охлаждения в следующих пределах:

• — устанавливаемая температура кристаллизации от 0 до -10°С (в зависимостиот состава криозащитной среды);
• — устанавливаемая предельная температура охлаждения —20…40°С;
• — устанавливаемая скорость снижения температуры с колебаниями, не превышающими 0,2 град/мин в интервалах: 0−0,55 град/мин; 0,55−1,2 град/мин; 1,2−3,0 град/мин.

Подготовку замораживателя к работе и замораживание эмбрионов проводят согласно инструкции. Пайеты в обязательном порядке запаивают (во избежание проникновения спирта внутрь пайеты) и для маркировки наносят надписи на пластмассовые пробки, вставленные в пайеты.

В процессе охлаждения температуру спирта в камере контролируют с помощью ртутного (марки ТЛ-4 ГОСТ 215–73) или толуолового (марки ТЛ-15 ТУ 25−11−964−74) термометров.

Полный цикл замораживания в устройстве ЭМБИ-К продолжается, в зависимости от выбранного режима охлаждения, от 35 минут до 1,5 часов.

Низкотемпературное хранение эмбрионов Пайеты с эмбрионами до использования хранят в сосудах Дьюара, заполненныхжидким азотом.

Пайеты для хранения помещают в специальные контейнеры. Кодовый номер наносят на алюминиевую пластинку.

Контейнер представляет собой прозрачную полипропиленовую трубку с наружным диаметром 4 мм, внутренним — 3,5 мм и длиной 180 мм. Один конец контейнера сужен до 1,5 мм. В качествемаркировочного элемента используют алюминиевую пластинку размером 32×4×1мм. На нее нанесен кодовый номер в виде колонки цифр, букв и их комбинаций. Размер пластинки позволяет нанести 5−6 легкочитаемых знаков. Таким образом, можно промаркировать десятки тысяч пайет с эмбрионами.

Контейнер с пайетойразмещают в канистре сосуда Дьюара. Канистра разделена на 6 пронумерованных секций, в каждой из которых помещают 5−6 контейнеров. Канистра делится на секции дюралюминиевой шайбой с пружинящими лепестками, надежно удерживающими ее в верхнейчасти канистры.

После окончания процесса замораживания пайеты с эмбрионами из камеры замораживателя переносят в теплоизолированную емкость, заполненную жидким азотом. Туда же помещают для предварительного охлаждения необходимое количество контейнеров.

У пайеты с эмбрионом удаляют промежуточную маркировочную пробку и быстро (2−3 секунды) переносят ее внутрь охлажденного контейнера, стараясь как можно меньше держать пайету вне жидкого азота. Промаркированные контейнеры быстро перекладывают в сосуд Дьюара, размещая их в канистрах.

Информацию о размещении контейнеров в канистрах, а также о самой пайете заносят в регистрационный журнал или при наличии компьютера в базу данных. В дальнейшем по имеющемуся на контейнере кодовому номеру можно получить всю информацию о его размещении и содержимом.

Необходимо систематически проверять уровень азота. Он не должен снижаться более, чем на половину объема сосуда.

Трансплантация эмбрионов лошадей Отбор кобыл в доноры и реципиенты В описанной методике извлечение эмбрионов у кобыл-доноров проводят в спонтанную или стимулированную охоту без индуцирования реакции полиовуляции.

В качестве доноров эмбрионов используют нормальных здоровых плодовитыхкобыл высокой и выдающейся племенной ценности по рекомендациям специалистов-селекционеров.

Оптимальный возраст кобылы-донора составляет 3−14 лет.

Кобылы-реципиенты должны быть клинически здоровы, с нормальной физиологией половой системы, без патологии половых путей, должны иметь развитое нормально функционирующее вымя. Реципиенты должны иметь крепкую конституцию и живую массу, соответствующую стандарту породы.

В качестве реципиентов используют наименее ценных и беспородных животных.

В период выбора животных для трансплантации (как доноров, так и реципиентов) с целью проверки состояния половой системы ранее холостивших, либо имевших патологические роды кобыл, их следует случить в одном-двух половых циклах с нормальным плодовитым жеребцом и через 8−9 дней после овуляции попытаться извлечь у них эмбрионыПри наличии в промывной жидкости жизнеспособного зародыша кобыла считается здоровой и отбирается для работы. При отрицательном результате в двух попытках предварительно намеченную кобылу выбраковывают.

В период подбора животных они должны быть подвергнуты всем необходимым ветеринарным обработкам и исследованиям, предусмотренным ветеринарными правилами.

Синхронизация половых циклов кобыл-доноров и кобыл-реципиентов Для успешного проведения трансплантации эмбрионов рекомендуется готовить на одну кобылу-донора 2−3 кобылы-реципиента.

Работу по предварительной синхронизации половых циклов начинают за один цикл до извлечения эмбриона и проводят по следующим схемам.

Схема 1. Если овуляция у кобылы-донора за цикл до пересадки наступила одновременно или чуть раньше (до трех суток), чем у потенциального реципиента, то в момент установления овуляции у донора в подготавливаемом цикле кобыле-реципиенту следует ввести внутривенно 2000 МЕ хорионического гонадотропина. Овуляция у реципиента должна наступить через 36−48 часов после инъекции. Асинхронность циклов донора и реципиента при этом составит 48 часов.

Схема 2. Бели овуляция наступила у кобылы-донора раньше, чем у реципиента на 3−10 суток, то в первый день проявления охоты у донора, кобыле-реципиенту следует ввести внутримышечно препарат простагландина Р-2а. Затем в день наступления овуляции у кобылы-донора кобыле-реципиенту вводят внутривенно 2000 МЕ хорионйческого гонадотропина.

Схема 3. Если за цикл до пересадки овуляция у кобылы-реципиента наступила раньше, чем у кобылы-донора на 2−6 дней, то через 6 дней после овуляции у кобылы-донора обеим кобылам (и донору, и реципиенту) вводят внутримышечно препарат простагландяна Р-2а и через 5 суток — внутривенно 2000 МЕ хорио-нического гонадотропина.

Охоту у кобыл-доноров и реципиентов определяют жеребцом-пробником ежедневно. При выявлений охоты ежедневно проводят двукратные ректальные исследования состояния яичников.

При наличии в яичнике кобылы-донора фолликула третьей стадии ее осеменяют или случают с намеченным по подбору жеребцом-производителем. Интервал между повторными случками либо осеменениями свежей спермой составляет 24 часа, при осеменении криоконсервированной спермой — 12 часов. Осеменение кобылы-донора прекращают после овуляции.

Одновременно с осеменением кобылы-донора проводят синхронизация полового цикла кобыл-реципиентов. Степень синхронности половых функций кобылы-донора и кобылы-реципиента находится в пределах от 24 до 72 часов.