Методы анализа микотоксинов

Термин микотоксины охватывает широкую группу соединений весьма отличающихся по своему химическому строению а, следовательно, по оказываемому токсическому действию. Необходимость четкого определения вида и концентрации микотоксина, содержащегося в том или ином корме обуславливается также возможной контаминацией их несколькими микотоксинами одновременно, что не позволяет четко поставить диагноз на микотоксикоз, основываясь только на клинической картине. Исследование проб кормов, проводимое с 2003 года подтвердило, что, как правило (85−90% случаев), в одном образце присутствует сразу несколько видов микотоксинов. Особенно это касается токсинов, продуцируемых грибами рода Fusarium. Можно сделать вывод, что есть потребность в аналитических методах исследования гарантирующих, что корма и продукты питания не содержат микотоксины выше допустимых пределов.

В настоящее время существует ряд приборных методов количественного определения микотоксинов в кормах и продуктах питания. Наиболее распространенными из них в настоящее время являются методики с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ, TLC), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, HPLC), газовой хроматографии (ГХ, GC), масс-спектрометрии (МС, MS) и их сочетаний.

Тонкослойная хроматография является хроматографической методикой, применяемой для разделения, оценки чистоты и идентификации органических соединений. Она основана на применении пластин с нанесенной неподвижной фазой и подвижной фазы (растворитель). Идентификация анализируемого вещества проводится при одновременном внесении на пластину экстракта образца и стандартных растворов с известной концентрацией. Различные соединения в смеси продвигаются по пластине с различной скоростью вследствие различия в закономерностях их разделения между мобильной жидкой и неподвижной фазами. На этом принципе основано разделение веществ в смеси экстракта. Флуоресцирующие вещества выявляют в УФ-свете, все остальные — с помощью специфических реагентов. Дальнейшее развитие метод получил под названием высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ, HPTLC). Уменьшение толщины слоя неподвижной фазы (до 100 мкм) и величины частиц (до 5 мкм), привело к лучшему разделению веществ за более короткий период времени. микотоксин зеараленон контаминация Методы ТСХ доступны почти для всех микотоксинов. Обнаружение и специфическая идентификация разработаны для каждого отдельного микотоксина, при этом используют молекулярные свойства или реакции трансформации веществ.

Главные недостатки тонкослойной хроматографии:

малая производительность;

большинство образцов нуждается в этапах экстракции и очистки для удаления потенциальных помех и матричных соединений перед анализом;

концентрация анализируемого вещества должна быть в диапазоне 0,01−0,1%;

использование токсичных и летучих веществ в качестве растворителя.

Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в области исследования микотоксинов главным образом используются для заключительного отделения матричных соединений и обнаружения интересующего анализируемого вещества. В настоящее время методы ВЭЖХ широко распространены из-за их превосходящих характеристик и надежности по сравнению с тонкослойной хроматографией. Методы ВЭЖХ были разработаны для большинства основных микотоксинов в зерновых культурах и другой сельскохозяйственной продукции. Большинство методов надежны и стабильны.

Метод ВЭЖХ основан на разделении анализируемого экстракта в неподвижной фазе хроматографической колонки (для анализа микотоксинов чаще используются колонки С8 и С18) и дальнейшей их идентификации и количественном определении с помощью специальных детекторов. Наиболее распространенными детекторами для анализа микотоксинов в настоящее время являются ультрафиолетовый и флуоресцентный. Пределы чувствительности методов ВЭЖХ с применением данных детекторов могут доходить до 1 мкг/кг образца. В литературе сообщалось о разработке методов ВЭЖХ для одновременного анализа нескольких микотоксинов. Особенно успешно таким образом анализируются трихотеценовые микотоксины, в частности трихотецены.

Другие методы по исследованию микотоксинов, использующие иммунологический подход, о которых сообщается в литературе, включают оптические и акустические биосенсоры, капиллярный электрофорез.

Мембранный тест позволяет за короткий период времени (около 10−15 мин) дать ответ на вопрос: присутствуют ли в испытуемом образце микотоксины выше уровня предела чувствительности данного теста. То есть фактически это качественное определение наличия/отсутствия микотоксинов в пробе. Метод требует экстракции, фильтрации, очистки (через колонку) и разведения образца. Далее раствор наносится на мембрану, сенсибилизированную моноклональными антителами, куда также добавляется ферментный конъюгат микотоксина. Если концентрация микотоксинов в образце превышает предел чувствительности теста, все антитела на поверхности связываются с ними и весь добавленный конъюгат удаляется на этапе отмывки. При добавлении бесцветного субстрата конъюгат на поверхности мембраны катализирует цветную реакцию, в результате которой на месте связывания конъюгата образуется цветное пятно. Окрашивание аналитической зоны мембраны говорит об отсутствии микотоксинов в образце.

Иммуноферментный анализ обычно используется для мониторинга наличия микотоксинов выше определенного уровня (или их отсутствия) в испытуемом образце. В настоящее время доступен ряд качественных, полуколичественных и количественных методов. Основываясь на результатах ИФА подозрительные образцы должны быть перепроверены классическими методами. Доступны различные варианты ИФА для анализа микотоксинов (например, мембранные тесты, микротитровальные планшеты и пробирочные методы). Как правило, метод ИФА основан на конкурентом анализе, который использует или связанные с ферментным конъюгатом микотоксинов, или антитела против определенного анализируемого токсина. Типичная последовательность реакций с использованием готовых реактивов в формате микротитровального планшета следующие:

ферментный конъюгат добавляется к экстракту испытуемого образца;

смесь добавляется к соответствующим антителам, нанесенным на поверхность лунок планшета (например, микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами);

количество соединенного с токсином конъюгата, связываемое иммобилизированными антителами, зависит от количества токсина в образце; чем выше количество токсина в образце, тем ниже будет количество ферментного конъюгата, присоединившегося к антителам, нанесенным на поверхность лунок планшета и наоборот;

ферментативная активность связанного с поверхностными антителами конъюгата определяется добавлением соответствующего субстрата, что приводит к образованию окрашенных продуктов, концентрация которых обратно пропорциональна концентрации токсина в испытуемом образце.

Можно провести анализ содержания микотоксинов в кормах с использованием иммуноферментного метода. Для исследования применим готовые тест-системы производства компании R-Biopharm, Германия. Этой компанией выпускается ряд наборов для количественного определения микотоксинов: афлатоксины В, G, М, зеараленон, охратоксин А, Т-2 токсин, дезоксиниваленол, фумонизин В1, цитринина. Следует отметить, что практически для всех перечисленных микотоксинов существуют варианты тест-систем для определения особо малых концентраций этих токсичных соединений с пределом чувствительности на уровне хроматографических методик (RIDASCREEN® Mycotoxins) (время инкубации 1−2 часа) и экспресс-методы, позволяющие определять практически такие же концентрации в течение 15−30 минут (RIDASCREEN® FAST Mycotoxins). Все методики прошли утверждение и могут использоваться в лабораториях, входящих в структуру Министерства сельского хозяйства и продовольствия.

Организация анализа микотоксинов в кормах и пищевых продуктах иммуноферментным методом возможна минимальными средствами и в самые короткие сроки. Простота эксплуатации и незначительная стоимость необходимого оборудования выгодно отличают иммуноферментный метод от классических методов анализа и делают его особенно привлекательным для лабораторий с ограниченными финансовыми возможностями.

Необходимо отметить, что при практически равных показателях пределов обнаружения методы иммуноферментного анализа являются более производительными и позволяют проводить избирательное исследование только подозрительных по ИФА образцов инструментальными методами. Например, методом ИФА один лаборант может провести исследование 10−100 образцов за одну рабочую смену, в то время как при использовании ВЭЖХ — только 1−10 проб. При этом на проведение иммуноферментного анализа затрачивается от 15 минут до 3 часов (пробоподготовка до 1 часа), а методом ВЭЖХ — 2−4 часа при 1−3-дневной пробоподготовке.