Общие положения селекции

на улучшение питательных качеств зерна злаков На долю растительных белков приходится около 70% всего потребляемого количества. Остальные 30% приходятся на долю белков животного происхождения. Главным источником растительных белков являются злаки. Поэтому селекция на повышенное содержание белка в зерне злаков имеет огромное значение. Белки злаков по биологической ценности уступают белкам зернобобовых и тем более белкам животного происхождения. Белки пшеницы по питательной ценности составляют 50% питательной ценности белка куриного яйца [35], а зеин кукурузы составляет 40% питательной ценности молока [25].

В связи с этим актуальнейшей задачей селекционных технологий является не только повышение валовой урожайности сельскохозяйственных растений, но и увеличение выхода белка, особенно увеличение его биологической ценности. При этом необходимо учитывать, что это связано с целым рядом трудностей. Существует отрицательная корреляция между урожайностью зерна и его белковостью. У американских высокобелковых линий кукурузы урожайность оказалась сниженной на 30%. При скрещивании с другими линиями были получены высокобелковые, но недостаточно урожайные формы, которые промышленного распространения не получили. Это явление объясняется, по-видимому, тем, что увеличение относительного содержания белка в зерне кукурузы почти всегда связано с подавлением синтеза каких-либо других компонентов. Известные в настоящее время пути повышения содержания белка в зерне кукурузы являются компромиссными, поскольку они достигаются ценой утраты других компонентов и снижения общего содержания белка. Мутантные формы озимой пшеницы Безостая 1 с высоким содержанием протеина — 18,3−23,2% (у исходного сорта — 15,4%) по продуктивности достигали лишь 30−60% урожая сорта Безостая 1.

Весьма важным моментом, как мы упомянули, является не только количество белка, но и его качественный состав, наличие незаменимых аминокислот и, в частности, лизина.

Как правило, колебания содержания лизина в зерне составляют от 1,77 до 4,55%. Изучение коллекций пшениц ВИРа показало, что в ней имеется более 100 сортов с содержанием этой незаменимой аминокислоты до 3,8%. Высокобелковые сорта пшеницы интенсивно накапливают запасные белки, особенно проламины, бедные лизином. Прирост белка в эндосперме пшеницы обусловливается на 55% повышенным содержанием глиадина, на 31% - глютелина и только на 14% - солерастворимых белков, богатых лизином. Внесение в почву азота способствует обогащению азотом зерна, но также за счёт проламиновой фракции. Повышение же содержания проламинов вызывает понижение сбалансированности белка по незаменимым аминокислотам и тем самым снижения его питательной ценности. Снижение содержания лизина в белке зерна с повышением белковости связано с тем, что проламины злаков накапливаются в зерне в последние фазы созревания наиболее энергично. Чем более благоприятными являются условия для накопления белка в зерне, тем больше накапливается проламинов и тем больше снижается содержание лизина в белке, хотяо бщее его содержание в зерне повышается. В неблагоприятных же условиях синтез белка прекращается раньше, проламинов накапливается меньше и возрастает содержание лизина в белке зерна.

Казалось бы, что подавление синтеза проламинов может явиться одним из путей увеличения содержания лизина. Но этот путь имеет ряд серьёзных отрицательных моментов. Современный сорт должен сочетать ряд свойств и качеств, урожайность, достаточное количество белка, сбалансированность по аминокислотному составу с экологической пластичностью, болезнеустойчивостью, отзывчивостью на прогрессивные агротехнические приёмы и т. д.

Был изучен аминокислотный состав зерна ряда сортов пшеницы, линий и видов Agropyron (житняк) и несколько видов элимусов. Больших различий в содержании большинства аминокислот не обнаружено. Наиболее изменчивым оказалось лишь содержание глутаминовой кислоты (9,2−12,7%) и пролина (11,7−34,1%) [35], (табл. 1) [26]. .

С точки зрения повышения лизина в зерне, безусловно, большой интерес представляет гибридизация пшеницы с близкими ей родами, например с рожью. Известно, что тритикале (пшеница х рожь) устойчиво превышает пшеницу (на 20%) по содержанию лизина. Но особенно интересны, по мнению академика Н. В. Цицина [35], в этом отношении костры, род Bromus — в его семенах содержание лизина значительно выше (в 1,5 раза), чем у пшеницы. Это объясняется тем, что проламины костров отличаются исключительно высоким содержанием лизина, в 2,5−3 раза превышающим его содержание в проламинах пшеницы и ржи.

Селекционеры стремятся подавить синтез проламинов в зерне злаков, содержание которых в пшенице и ячмене составляет в среднем около 35% от общего азота, и поднять таким образом содержание лизина в зерне. Но это повлечёт за собой снижение биологической устойчивости злаков и снижение технологических качеств зерна. Если же методом отдалённой гибридизации заменить проламины пшеницы на проламины костра, то можно получить новый злак пшеничного типа с содержанием лизина в зерне до 4% .

В 1964 году впервые было сообщено об обнаружении зерна кукурузы, имеющего высокопитательный, сбалансированный по незаменимым аминокислотам белковый комплекс [41]. К этому времени представление об ограниченности пищевых и прочих ресурсов Земли на фоне быстрого роста населения планеты привлекло к себе пристальное внимание ученых различных стран и разных областей знаний. Медицинские исследования, проводимые в развивающихся странах, а также данные ФАО по пищевым ресурсам с особой остротой поставили вопрос о необходимости обогащения белка злаков незаменимыми аминокислотами, учитывая, что именно зерновые являются основным поставщиком белков, потребляемых человечеством.

высоколизиновый кукуруза мутация метаболизм Таблица 1 — Содержание незаменимых аминокислот в белках разной биологической ценности [26].

ФАО — Международная организация по сельскому хозяйству и продовольствию при ООН; ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения.

При детальном анализе было установлено, что основной лимитирующей аминокислотой является лизин. Особенно беден лизином белок зерна кукурузы, так как зеины — основные запасные белки кукурузы — практически не содержат этой аминокислоты [5, 24, 25, 42−44, 51].

Мутант кукурузы opaque-2 описан впервые Синглетоном и Джонсоном в начале 20-х годов прошлого столетия [49]. Эта мутация определяется изменением рецессивного гена, локализованного на 7-ой хромосоме генома кукурузы, и фенотипически проявляется только в триплоидном эндосперме, где детерминирует непрозрачность обычно прозрачного зрелого зерна.

До 1964 года попытки улучшить питательные качества зерна кукурузы осуществлялись путём увеличения уровня белка в результате применения азотных удобрений. Мутант opaque-2 впервые показал возможность нарушения взаимосвязи: увеличение азотного питания — увеличение содержания проламинов — снижение питательной ценности эндосперма, которая до открытия биохимического действия мутанта считалась почти догмой.

Нельсон, работавший в 1963 году в Университете Пардью в США, предложил концепцию, согласно которой такое уменьшение прозрачности ткани эндосперма обусловлено изменением состава белков. Он отобрал несколько зерен кукурузы с непрозрачным эндоспермом и вместе с другими образцами зерна передал их в том же университете для аминокислотного анализа Мерцу. Оказалось, что мутант opaque-2 имеет существенно улучшенный баланс аминокислот. У него увеличилось количество лизина на 69% (с 2,0 до 3,39%) и других незаменимых аминокислот — треонина и валина. Позднее было найдено, что содержание триптофана (аминокислоты столь же важной, как и лизин в кукурузе) значительно возрастает в семенах такого типа (табл. 2, 3). Опыты подтвердили, что питательная ценность такого зерна существенно улучшилась. Животные и даже дети хорошо росли на этой новой высоколизиновой кукурузе [24, 25, 26, 41−44] (таблица 4). Исследования Мерца и соавторов своим новым и оригинальным подходом вызвали определённый энтузиазм среди учёных и селекционеров, работающих в области улучшения качества белка.

Главные гены, определяющие высокий лизин наследуются просто, но отличаются очень сложным фенотипическим проявлением. Мерц определил эту ситуацию как «высоколизиновый синдром», уподобив её наследственной болезни обмена веществ, выражающейся в дефиците проламина или в хронической гипераминокислотности [42−44].

Таблица 2 — Влияния мутации регуляторного гена opaque-2 на биологические и биохимические показатели зерна кукурузы [29].

Таблица 3 — Сравнительное содержание воды, белка и белковых фракций в % абсолютно сухого вещества в ходе созревания эндосперма зерна кукурузы линии Висконсин 64А обычной (+/+) и мутантной по гену opaque-2 (о₂/о₂) [29].

С 1966 года в Краснодарском НИИ сельского хозяйства им. П. П. Лукьяненко академик М. И. Хаджинов первым в СССР начал селекционную работу по повышению содержания лизина в зерне кукурузы. Для реализации селекционной программы была создана биохимическая лаборатория с виварием, позволяющим проводить биологическую оценку новых линий и гибридов кукурузы, сортов пшеницы и ячменя Одновременно разрабатывались теоретические основы влияния имбаланса аминокислот на биохимические и молекулярно-биологические особенности метаболизма животных и концепция создания высоколизиновой кукурузы на основе молекулярно-биологических исследований созревающего зерна кукурузы.

Таблица 4- Рост, затраты корма и использование азота при кормлении свиней породы Ландрас зерном обычной и высоколизиновой кукурузой [25].

Значение мутации регуляторного гена opaque-2 как объекта научных исследований Начало ХХI века ознаменовано прорывом в области познания и практического использования в медицине и сельском хозяйстве регуляции экспрессии генов в связи с открытием явления РНК-интерференции. Это открыло принципиально новые перспективы в решении проблемы улучшения питательных свойств зерна сельскохозяйственных растений, о которых будет рассказано ниже.

Однако многие практические задачи не имеют пока что своего решения из-за слабого знания молекулярных процессов, определяющих их формирование. Как и прежде объектами исследований в науке остаются три явления, исследования которых в сравнении с нормой дают основную массу новых знаний — это мутации, стрессы и болезни. В последнее время этот весьма неширокий набор стратегических направлений исследований пополнился ещё одним компонентом, и триада превратилась в тетраду — это трансгенные организмы, исследование особенностей метаболизма которых позволяет лучше понять регуляцию экспрессии генов.

В этом ряду объектов научного поиска мутация гена opaque-2 занимает особое место, поскольку в отличие от большого количества мутаций, являющихся предметом фундаментальных исследований, мутация этого регуляторного гена, обладающего широким плейотропным эффектом, имеет выраженное практическое приложение в решении крупнейшей сельскохозяйственной задачи — улучшения питательных свойств зерна. В 1964 году впервые было сообщено об обнаружении зерна кукурузы, имеющего высокопитательный, сбалансированный по незаменимым аминокислотам белковый комплекс [41]. Вскоре после открытия биохимического действия гена opaque-2 на основе закона гомологических рядов в наследственной изменчивости Н. И. Вавилова гомологичные высоколизиновые мутанты были искусственно получены или найдены у ячменя (Ризо 1508) [52], озимой пшеницы [47] и сорго (HL) [5], которым в значительной степени свойственен комплекс признаков, определённый как «высоколизиновый синдром». Очевидно, что относительное перераспределение белков эндосперма (уменьшение содержания спирторастворимого проламина при недостатке лизина в нём и увеличение количества богатых лизином водорастворимых и солерастворимых белков — альбуминов и глобулинов) как следствие нарушения превращения лизина в глутамин является основным общим признаком этих мутантов [10, 24].

Открытие биохимического действия гена opaque-2 стимулировало в 1960;е-1970;е годы, с одной стороны, селекционные работы по созданию высоколизиновой кукурузы с использованием доноров мутантного гена opaque-2, а с другой стороны, привлекло внимание биохимиков и молекулярных биологов к исследованию созревающего зерна кукурузы.

Однако, большим надеждам на создание высоколизиновой кукурузы не суждено было сбыться из-за широкого плейотропного действия мутантного гена, приводящего не только к улучшению питательных свойств зерна, но и к значительному ухудшению его физических свойств: снижению плотности и прочности, повышенной поражаемости насекомыми и патогенами, снижению урожая [41−44].

Обычно 25 лет считаются мировым опытом «рентабельными» для исследования подобных природных феноменов. Если в этот срок не получены вполне определённые практические результаты, происходит резкий отток инвестиций от не оправдавшей себя тематики. К сожалению, так произошло и с попытками создания высоколизиновой кукурузы на основе мутации гена opaque-2.

Тем не менее, широкомасштабные биохимические и молекулярно-биологические исследования мутации этого регуляторного гена обогатили науку представлениями о конкретных молекулярных процессах регуляции экспрессии генов, как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровне [10]. В ходе этих работ методами генной инженерии были выделены и изучены большое количество генов запасных белков кукурузы — зеинов [39], а тккже ряда незеиновых белков [37, 49]. Сам регуляторный ген opaque-2 был извлечён из генома кукурузы в элегантных экспериментах с применением транспозонного мечения [45, 48].

Первичная последовательность аминокислот, считанная с кДНК opaque-2, показала, что продукт этого гена — белок, имеющий лейциновую «застёжку-молнию» (bZIP), является транскрипционным регулятором всех генов проламинов (зеинов) зерна кукурузы, но особенно специфичен для генов зеинов 22 кДа и гена opaque-6, а также гена пируват ортофосфат дикиназы.

Продукт гена opaque-6 является рибосоморазрушающим белком (RIP), обеспечивающим в норме устойчивость зерна кукурузы к поражению фитопатогенами при прорастании, специфически разрушая их рибосомы. Поскольку РНК-связывающие белки участвуют в регуляции развития на посттранскрипционном уровне, предполагается, что b32 может влиять на трансляционную машину клеток эндосперма кукурузы, например, усиливать синтез зеиновых белков [10].

Пируват ортофосфат дикиназа — основной регулятор гликолиза, имеющего отношение, как к углеводному, так и аминокислотному метаболизму (превращает пируват в фосфопируват). Таким образом, opaque-2 повышает уровень свободных аминокислот, оказывая влияние на различные энзиматические стадии гликолиза, цикла трикарбоновых кислот, синтеза и деградации аминокислот [10].

Данные, полученные с помощью метода биологических микрочипов, позволяют предполагать, что продукт гена opaque-2 является трансрипционным активатором ещё не менее 30-ти генов [39]. Однако эти гены могут регулироваться и на посттранскрипционном уровне.

Исследования in vitro показали, что белок opaque-2 связывается с промоторами генов б-зеинов 22 кДа по последовательности 5'-TCCACGTAGA-3', которая имеет большое сходство со специфическими мишенями других bZIP белков [49].

Вместе с тем, терминальная полиадениловая последовательность на 3'-некодирующей области определяет как стабильности мРНК, так и её трансляционную активность: чем длиннее поли-(А)-хвост, тем стабильнее мРНК и тем выше её трансляционная активность (энхансер трансляции). Ступенчатая температурная элюция полиаденилированной мРНК с колонки поли-(У)-сефарозы в ходе аффнной хроматографии показала, что в созревающем мутантном эндосперме соотношение — (А)_n65?/(А)_n35? — фракций мРНК, элюируемых с колонки при температуре 65^оС (длиннохвостовые молекулы) и при температуре 35^оС (короткохвостовые молекулы) составляло у обычной и opaque-2 кукурузы, соответственно, для белковых тел — 0,88 и 0,75, для микросом — 0,55 и 0,36, для свободных полисом 1,10 и 0,16, для информосом 0,63 и 0,37 [11].. Укороченная терминальная поли-(А)-последовательность, по-видимому, является причиной сравнительно низкой трансляционной активности свободных и мембраносвязанных полирибосом из созревающего зерна мутанта opaque-2 в бесклеточной системе синтеза белка (in vitro) [15]. Вместе с тем стабильность как суммарной мРНК, так и мРНК зеинов в созревающем зерне мутанта opaque-2 выше, чем в зерне обычной кукурузы, что, по-видимому, определяется отсутствием у мутанта короткоживущих фракций мРНК и сравнительно низкой скоростью деаденилирования мРНК [10].

Эти факты указывают на значительную роль посттранскрипционного уровня регуляции генов при формировании высоколизинового синдрома, наряду с транскрипционным уровнем.

Созревающее зерно этого мутанта использовалось как великолепная модельная система для доказательства тождества магний-зависимого распада мРНК in vivo и in vitro (система ommp — от латинского выражения «omnia mea mecum porto» -всё своё ношу с собой) [7, 10, 17−22], а также при разработке нанобиотехнологических методов исследования нуклеиновых кислот [1, 9, 10, 23]. Тем более, что «высоколизиновый синдром» оказался весьма схожим с «адаптационным синдромом», комплексом биохимических и физиологических изменений, возникающих в клетках растений в ответ на различные виды стресса [8, 10 ].