Хроматографические методы. 
Разработка методики определения альфа-токоферола ацетата в лекарственном препарате методом капиллярной газовой хроматографии

Анализ литературных источников показал, что в начале второго десятилетия XXI века ведущее положение при определении жирорастворимых витаминов (в т.ч. витамина Е) занимают исключительно хроматографические методы. В мировой научной литературе около 95% работ посвящено современным хроматографическим методам для контроля качества и стандартизации различных лекарственных средств. Наибольшее применение получили методы ВЭЖХ и ТСХ.

Метод ВЭЖХ с использованием различных детекторов (спектрофотометрических, флуоресцентных, ИК-фурье, масс-спектрометрических) в последние годы получил более широкое признание в фармацевтическом анализе для количественного определения токоферолов. В зарубежных государственных фармакопеях данный метод применяют в качестве основного для определения витамина Е в лекарственных формах. В USP 24 издания описаны три метода определения б-токоферола (таблица 1), различающиеся предподготовкой пробы, а также качественным и количественным составом подвижной фазы. Детектирование осуществляют с помощью УФ-детектора при длине волны 285 нм.

Таблица 1 — Примеры методик USP 24 анализа витамина Е в лекарственных формах.

Описан способ определения жирорастворимых витаминов, исключающий стадию омыления [21]. При этом исследовались гетерогенные системы: этанол (96%) — растительное масло с добавками витаминов. Детектирование токоферола проводили при 292 нм (рисунок 4).

Рисунок 4 — Хроматограмма этанольной фазы гетерогенной системы этанол-растительное масло, содержащее ретинол и б-токоферол: 1 — ретинол; 2 — б-токоферол.

Хроматографическое определение жирорастворимых витаминов (A, D3, E) методом ОФ ВЭЖХ перспективно для решения аналитических задач в производственных условиях. В качестве объектов исследования применяют фармакопейные препараты жирорастворимых витаминов. Идентифицируют пики по временам удерживания витаминов. Для разделения смеси жирорастворимых витаминов наилучшей является подвижная фаза состава вода — изопропиловый спирт в соотношении 30: 70 (рисунок 5). Объем вводимой пробы 1 мкл. Определение проводят по градуировочной зависимости высоты пика h (см) от содержания витамина Е (мг/мл).

Рисунок 5 — Хроматограмма смеси жирорастворимых витаминов: подвижная фаза — смесь воды и изопропанола (30:70): 1 — витамин К3 (0,24 мкг); 2 — витамин, А (2,0 мкг); 3 — витамин D3 (27 мкг); 4 — витамин Е (64 мкг).

Изучено поведение витаминов Е и D3 при совместном присутствии в условиях ОФ ВЭЖХ с использованием немодифицированных и модифицированных подвижных фаз. Для косвенного спектрофотометрического детектирования витаминов выбран ацетонитрил, модифицированный хлорофиллом (а+в) и тетрафенилпорфирином. При этом пределы обнаружения веществ с данным способом детектирования (нг) превосходят чувствительность УФ-детектора (мкг) и сравнимы с флуориметрическим (нг) детектированием.

ВЭЖХ, в соответствии с современным уровнем развития фармацевтической науки, вытесняет спектральные методы анализа водои жирорастворимых витаминов. Так, в последнюю ГФ XIII издания [23] включена общая фармакопейная статья «Количественное определение витаминов», в которой определение витамина Е после омыления пробы рекомендуется проводить методом ОФ ВЭЖХ с детектированием при 292 нм. Возможно также одновременно определять витамины, А и Е, проводя детектирование при длине волны 300 нм.

Была разработана унифицированная упрощенная методика, основанная на применении ВЭЖХ для качественного и количественного анализа жирорастворимых витаминов А, D и Е при их совместном присутствии в многокомпонентных витаминных препаратах, исключающая большинство вспомогательных операций при подготовке образцов к анализу. Извлечение жирорастворимых витаминов проводилось в одну операцию — сначала проба обрабатывалась 0,05 М раствором хлористоводородной кислоты, затем смесью эфира и этанола.

Разработаны методики определения изомеров токоферола в капсулах витамина Е (рисунок 6) с применением нормально-фазового варианта ВЭЖХ и флуоресцентного способа детектирования (лex 295 нм, леm 340 нм).

Рисунок 6 — Определение изомеров токоферола в капсуле витамина Е.

Несмотря на вышеперечисленные достоинства метода ВЭЖХ, высокая стоимость оборудования существенно ограничивает его применение в аналитических лабораториях.

Метод ТСХ в настоящее время в фармацевтическом анализе токоферолов применяют для оценки подлинности и чистоты субстанций и лекарственных форм. Группу токоферолов определяют по величинам Rf после хроматографирования в условиях, представленных в таблице 2.

Таблица 2 — Характеристика условий хроматографического определения б-токоферола методом ТСХ.

В качестве реагентов-детекторов могут использоваться: реактив Эммера-Энгели — токоферолы окрашиваются в розовый или красный цвет на белом фоне; растворы фосфорно-молибденовой кислоты — на желто-зеленом фоне наблюдается окрашивание в сине-голубой цвет; водный раствор нитрата серебра — на белом фоне токоферолы окрашиваются в красный цвет и водный раствор гексацианоферрата калия (III) — на синем фоне имеет место окрашивание в желто-оранжевый цвет.

В последнее время стали появляться публикации, свидетельствующие о возможностях ТСХ для количественного анализа с применением специализированного программного обеспечения, не требующих наличия дорогостоящих аналитических приборов и позволяющих объективно количественно оценить содержание вещества при минимальных затратах времени. Разработаны методики идентификации и количественного определения б-токоферола методом хроматографии в тонком слое сорбента с применением обработки сканированных хроматограмм компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer».

Методы ТСХ часто объединяют с ГЖХ, поскольку последняя отличается большей чувствительностью и более пригодна для количественных определений. В этом случае пластинки опрыскивают раствором родамина G или 2,7-дихлрфлуоресцеина (либо хроматографию проводят на пластинках, содержащих указанные флуоресцентные индикаторы), соединения группы витамина Е обнаруживают по тушению индуцированной УФ-облучением флуоресценции, соответствующие зоны сорбента соскабливают, вещества экстрагируют и анализируют с помощью ГЖХ. Высокой разрешающей способностью обладают открытые капиллярные колонки с непористым слоем, внутренняя поверхность которых дезактивирована силаноксом и покрыта полярной фазой — сульфоном полифенилового эфира. На таких колонках разделяют токоферолы в виде их триметилсилильных производных.

Газовая хроматография.

ГЖХ — экспрессный и точный метод анализа, но его основным недостатком является тот факт, что в нативном виде токоферолы не определяются. Необходима длительная предподготовка пробы, заключающаяся в предварительном переведении витамина Е в метиловый или пропиловый эфир, гептафторбутирильные или триметилсилилпроизводные, что увеличивает ошибку анализа. Однако метод газовой хроматографии успешно используется для определения б-токоферилацетата и часто рекомендуется для анализа субстанции и масляных растворов витамина Е.

В соответствии с ГФ XII б-токоферола ацетат определяют методом ГЖХ с применением внутреннего стандарта дотриокантана и пламенно-ионизационного детектора. В Фармакопее США USP 30 описана методика определения б-токоферола, его ацетата и сукцината, а также смеси изомеров (в-, б-, ди г-), полученной из растительных масел, методом ГЖХ с применением пламенно-ионизационного детектора. В качестве внутреннего стандарта в анализируемую пробу вводят гексадецилгексадеканоат. Следует отметить, что в предлагаемых условиях не наблюдается разделения пиков ви г-токоферолов.

Была изучена возможность определения витамина Е в масляных растворах фармацевтических препаратов как методом прямой капиллярной хроматографии, так и с предварительным выделением его из масляных растворов экстракцией этанолом. Результаты по оценке выхода б-токоферилацетата из масляных растворов и правильности результатов анализа, представленные в таблице 3, показали возможность использования прямой капиллярной хроматографии.

Таблица 3 — Результаты определения выхода б-токоферилацетата (ТФА) из масляных растворов и проверка правильности методики (n=5; Р=0,95).

Разработанная методика применена к анализу трех фармпрепаратов: 50%-ного масляного раствора витамина Е в капсулах, 30%-ного масляного раствора для инъекций, препарата «Левит». Компоненты масляной основы не хроматографировались и не мешали определению витамина Е.

Методика проста по технике выполнения, не требует предварительной пробоподготовки, характеризуется малым временем анализа и имеет хорошую воспроизводимость (относительное стандартное отклонение среднего определения 0,03−0,05). Кроме того, методика позволяет сочетать количественный анализ с оценкой качества фармпрепарата.

Задачи для исследования

Цель исследовательской работы состоит в разработке методики определения б-токоферола ацетата в лекарственном препарате методом капиллярной газовой хроматографии.

Для достижения этой цели были поставленны следующие задачи:

• — приобрести навыки работы на газовом хроматографе «Кристалл-люкс 4000М»;
• — изучить влияние различных факторов на эффективность газохроматографического анализа б-токоферилацетата;
• — выбрать оптимальные условия хроматографирования;
• — определить содержание б-токоферола ацетата в масляном растворе витамина Е;
• — провести анализ полученных данных, сделать необходимые выводы.