Понятие криоцервации и витрификации. 
Криопротекторы. 
Перспективы применения метода витрификации в медицине

Понятие криоцервации и витрификации. Криопротекторы. Перспективы применения метода витрификации в медицине

Ученые США обнаружили неизвестные ранее способности организмов выживать в условиях смертоносного холода через временное замедление поддерживающих жизнь биологических процессов.

«Мы обнаружили, что расширение пределов выживания в холоде возможно, если потребление кислорода снизилось впервые», — заметил исследователь Марк Рот из Центра исследования рака имени Фреда Хатчинсона в Сиэтле, штат Вашингтон.

В ходе экспериментов Рот и его коллеги следили за жизнедеятельностью зародышей червей и дрожжевых грибов. Когда тех в обычных условиях охлаждали до точки замерзания воды, в течение суток 99 процентов этих «весьма разных организмов» погибало. Но при предварительном лишении доступа к кислороду 66 процентов дрожжей и 97 процентов червей выживали. Впоследствии — «отогревшись» и «отдышавшись» — они возвращались к жизни и проживали обычный для таких организмов срок.

На специальных видеозаписях ученые наблюдали, как в эмбрионе червя при наступлении резкого кислородного голодания прекращался процесс деления клеток, прежде весьма активный. Через два с половиной часа после возобновления подачи кислорода клетки снова начинали делиться.

Один из авторов новой работы — сотрудник онкологического исследовательского института им. Фреда Хатчинсона Марк Рот — говорит, что полученные результаты могут иметь важное прикладное значение для продления «срока годности» органов человеческого тела, предназначенных для трансплантации. Кроме того, исследование может быть важно и для повышения шансов на выживание пациентов в экстремальных ситуациях, когда им невозможно сразу оказать должную медицинскую помощь.

Новый эксперимент также может объяснить то, что до сих пор было неразрешимой загадкой: сообщения о случаях «возвращения людей к жизни» после гипотермии.

«В научной литературе есть много примеров с людьми, которые казались замерзшими до смерти. У них отсутствует сердцебиение и они клинически мертвы, но они могут быть возвращены к жизни», говорит Рот. «Точно так же организмы в моей лаборатории могут быть введены в состояние анабиоза обратимым путем лишения их кислорода и другими средствами. Они будут выглядеть мертвыми, хотя это совсем не так», сказал исследователь.

На изучения взаимосвязи между человеческой гипотермией и его собственными исследованиями принудительной спячки Марка Рота впервые вдохновили документально подтвержденные случаи успешно вернувшихся к жизни людей, которые пробыли несколько часов или дней без пульса в весьма холодных условиях.

Зимой 2001 года температура тела канадской девочки Эрики Норби упала до 16 градусов по Цельсию — пролежала в течение нескольких часов при минусовой погоде после скитаний в одном подгузнике безо всякой одежды. Казавшаяся мертвой, она полностью оправилась после того, как отогрелась и вернулась к жизни.

Та же любопытная участь в 2006 году постигла и японского альпиниста Митсутаку Учикоши. Он был обнаружен при температуре тела 21.6°C спустя 23 дня после того, как заснул на заснеженной горе.

В целом, геронтологи утверждают, что снижение температуры тела у теплокровных животных на 2−3 градуса увеличивает продолжительность жизни в два раза, а если снизить температуру тела на 10 градусов, то срок жизни можно увеличить в 14 раз. Ученые объясняют это тем, что при снижении температуры тела уменьшается скорость биохимических реакций в организме, а сам организм меньше засоряется разного рода шлаками и токсинами.

На специальных видеозаписях ученые наблюдали, как в эмбрионе червя при наступлении резкого кислородного голодания прекращался процесс деления клеток, прежде весьма активный. Через два с половиной часа после возобновления подачи кислорода клетки снова начинали делиться.

Целью моей работы является изучение истоков криобиологии и витрификации. Понять, что они представляют из себя. Изучить витрификацию живых объектов. Объяснить криопротективное действие определенных веществ. А также понять, как же вышеперечисленные методы применяют в современной медицине.

1. История криоцервации и витрификации

медицина криоцервацие витрификация Температура в наибольшей степени тормозит скорость и влияет на характер течения обменных процессов в живых системах. Поскольку обмен веществ, составляющий основу жизни, протекает при участии водорастворимых ферментов, то температура, модифицирующая состояние жидкой воды, влияет на интенсивность ферментативных реакций.

Математическое выражение скорости химических процессов в зависимости от изменения температуры, предложенное Я.Г. Ван-Гоффом в 1887 г., постулирует, что все химические реакции при повышении температуры на 10 °C ускоряются в 2−3 раза. Эта зависимость между скоростью течения химических реакций и температурой в большей или меньшей мере обнаруживается во многих жизненных процессах.

Один из крупных исследователей анабиоза П. Беккерель, рассчитывая скорость процесса обмена веществ в спорах и семенах при различных температурах, установил, что при -100°С обмен протекает в 85 — 10 раз медленнее, чем при 20 °C. Беккерель подвергал семена табака, клевера, лютика, льнянки и других растений воздействию низких температур и высушиванию при 40 °C в запаянных трубках в сильно разреженной атмосфере, после чего держал их в этих условиях 4 месяца, а затем охлаждал до температуры жидкого гелия (-269°С). При проращивании эти семена всходили аналогично контрольным. Опыты, в которых семена различной природы подвергались высушиванию, охлаждению либо действию обоих этих факторов, показали, что в выживаемости клеток играет важную роль вода, которая определяет все особенности процессов жизнедеятельности и интенсивности обмена веществ. Низкое содержание воды в семенах, очевидно, явилось решающим условием для сохранения жизнеспособности при очень низких температурах.

Следует отметить, что эффекты низких температур по отношению к биообъектам наблюдали в глубокой древности. Еще Овидий Назон, а также Плиний во II—III вв. до н.э. описали поведение рыб, замерзших во льду, часть из которых после нагрева оказалась живой.

Л. Спалланцанн изучал действие низкотемпературного высушивания на коловраток при естественном (-7°С) и искусственно (-19… — 21 и -28°С) замораживании в смеси льда, каменной соли и азотной кислоты. Во всех случаях замораживания коловратки теряли признаки жизни, однако после подогрева песка или воды до обычной температуры они оживали. В его монографии «Исследования по живой и растительной физике» подчеркивается, что имеется тесная зависимость между действием высушивания — охлаждения и жизнеспособностью, что неоднократно акцентуировалось в работах современных криобиологов, которые обращали внимание на роль дегидратации в сохранении жизнеспособности биообъектов после перевода их в анабиотическое состояние. Эти опыты показали, что предотвратить криоповреждения в биообъектах без предварительного удаления части свободной воды из них практически невозможно.

Изучение действия холода на рыб, амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих привело Л. Спалланцанн к выводу, что при охлаждении земноводных нарушается в основном кровообращение в мелких сосудах, которое при дальнейшем понижении температуры тела полностью прекращается и в крупных, сосудах, вызывая смерть животных. Л. Спалланцанн также выявил, что спермин значительно лучше переносят сильное охлаждение, чем животные, от которых они были получены.

По настоящее время не прекращаются попытки раскрыть сущность анабиоза, поскольку затрагивают общебиологические и физиологические аспекты естествознания, связанные как с возможностью управления жизненными функциями, так и с попыткой решить проблемы возникновения жизни на Земле и, возможно, во Вселенной. В начале XIX в. было замечено, что некоторые виды организмов после замораживания могут погибать либо выдерживать охлаждение и после отогрева оживать.

На рубеже XX в. немецкий физиолог Р. Кокс охлаждал живые существа и пришел к выводу, что холоднокровные животные оживают после охлаждения в том случае, если в организме содержится незакристаллизовавшаяся жидкая часть. Швейцарский физик М. Пиктэ, известный в то время своими работами по сжижению газов, начал исследования по охлаждению животных и рыб после того, как установил, что при -30°С все химические реакции тормозятся. Опыты на теплокровных животных (собаки, морские свинки) показали, что они не выдерживают охлаждения даже в области положительных температур. М. Пиктэ пришел к выводу, что чем ниже организованы живые существа, тем ниже температуры без вреда для себя они переносят.

Процесс вымораживания воды изучался русским физиком и энтомологом П. И. Бахметьевым (1912), который обратил внимание на то, что в опытах по охлаждению живых систем отсутствуют точные данные об измерении температуры тела животных. Это натолкнуло его на мысль исследовать температуру тела насекомых при изменении температурных условий их существования. Для этого он предложил способ прямого измерения температуры тела экспериментальных животных с помощью термоэлектрического термометра и систему математической обработки экспериментальных данных, что позволяло определить удельную теплоту тела и скрытую теплоту таяния замерзшей в нем жидкости. Поэтому именно исследования П. И. Бахметьева благодаря более совершенному подходу к изучаемой проблеме позволили расширить сведения об обратимой остановке жизнедеятельности организма, наступающей под воздействием низких температур, и положить начало изучению практически не известных до этого закономерностей полного, но обратимого прекращения жизнедеятельности.

При помощи калориметрических исследований П. И. Бахметьеым изучался процесс вымораживания воды из тела насекомых, который выражался в виде характерной температурной кривой. Открыто явление физического переохлаждения тканевых жидкостей и впервые указано на возможность приостановления активного состояния живой материи с помощью низких температур в нужный момент. П. И. Бахметьев отметил, что в процессе кристаллизации, развивающемся' в теле насекомого, растущие кристаллы льда поглощают воду из окружающих, не охваченных процессом кристаллизации тканей, т. е. этот процесс сопровождается обезвоживанием тканей. При этом происходит интенсивное их высушивание, в результате чего коллоиды претерпевают изменения различной степени и при оттаивании насекомые погибают. Эти исследования выделили два важных процесса: кристаллизацию тканей и их дегидратацию, которые позднее стали краеугольными камнями теории криоповреждения и криозащиты.

Д.Б. Лейн (1925) показал, что содержание в растворах эвтектической концентрации глицерина (66,7%) с очень низкой эвтектической точкой. (-46,5°С) значительно перемещает зоны эвтектики этих растворов в сторону отрицательных температур. Поскольку глицерин хорошо проникает в клетки, он препятствует кристаллообразованию в них. При снижении температуры ниже указанных величин развиваются процессы кристаллизации и в конечном счете жидкая фаза переходит в твердое состояние. По мере уменьшения температуры биологического объекта падает и уровень обменных процессов, причем А. Бюфон и Д. Гамель (1737) одними из первых установили, что причиной гибели клетки при замораживании является кристаллизация льда, приводящая к разрыву клетки. Однако позже авторы пришли к выводу, что повреждение живых систем при их замораживании обусловлено-химическими и физико-химическими изменениями, сопровождающими процесс кристаллизации.

Н.И. Максимов (1908, 1913) развил теорию замораживания. Согласно его данным, протоплазма клеток замораживаемого растения испытывает давление со стороны растущих в межклетниках или между протоплазмой и оболочкой клеток ледяных кристаллов. Наряду с механическим воздействием происходит криоповреждение клеток в силу обезвоживающего влияния низких температур. В результате роста кристаллов льда в межклеточных пространствах происходит сближение и соединение коллоидальных частиц протоплазмы. Очевидно, образующийся при замораживании растений лед оказывает водоотнимающее и механически коагулирующее действие на коллоидальные вещества протоплазмы. Н. И. Максимов пришел к выводу, что наиболее чувствительным к понижению температуры является поверхностный слой протоплазмы, при повреждении которого нарушаются осмотические свойства клетки. Температура замерзания живых систем растительного и животного происхождения является величиной постоянной и зависит главным образом от условий замораживания и температуры окружающей среды. Непостоянство точки замерзания клеток объясняется тем, что она представляет собой результат подвижного равновесия между скоростью охлаждения объекта, регулируемой внешней температурой, и скоростью образования льда, определяемой скоростью прохождения воды через протоплазм этическую мембрану.

По мнению Н. И. Максимова, степень отмирания подвергнутых замораживанию клеток определяется не столько достижением минимальной температуры, сколько количеством образовавшегося в их тканях льда, который способствует обезвоживанию клеток и оказывает механически коагулирующее действие на их протоплазму.

Положения, выдвинутые этим ученым в отношении значения обезвоживания живых систем из-за превращения воды в лед, способствующего увеличению концентрации электролитов, осмотического давления, сдвигу рН, явились основой современных представлений о механизме повреждения клеток при замораживании-оттаивании.

Решающим фактором, определяющим повреждение живых систем в условиях глубокого холода, являются химические и физико-химические изменения, происходящие внутри и вне клетки. Степень их проявления зависит от скорости и интенсивности вымораживания воды в процессе кристаллизации. В начале 50-х г. Дж. Лавлоком была создана одна из первых научно обоснованных теорий криоповреждений. На основании опытов по замораживанию эритроцитов он пришел к выводу, что ведущей причиной и гемолиза является повреждение мембраны, образованной из липопротеидных комплексов. Криоразрушение мембраны и гемолиз клеток происходят в результате увеличения концентрации солей, что приводит к повышению в среде ионной силы, дестабилизирующей компоненты клеточной мембраны, вследствие чего происходит выход из ее состава фосфолипидов и холестерина. Потеря фосфолипидов делает мембрану проницаемой для катионов, что обусловливает ее коллоидно-осмотическое набухание и в конечном счете разрыв. Дж. Лавлок показал, что лед образуется не в виде монолита, а состоит из отдельных кристаллов, образующих каналы, в промежутках которых находится концентрированный солевой раствор. При понижении температуры с усилением роста кристаллов уменьшается просвет между ними и повышается концентрация раствора. На существование бесконечной сети таких каналов между кристаллами льда указал Словитер (1951;1952), наблюдавший при замораживании до -26°С эритроцитов в. 0,25%-м растворе NaCI и 15%-й концентрации глицерина образование равномерно окрашенной в красный цвет жидкости, в которой через неделю формировался темно-красный осадок клеток, что являлось результатом их перемещения и сдавливания в каналах.

Дальнейшее углубление представлений о температурном шоке клеток нашло отражение в работах А. М. Белоуса и В. А. Бондаренко (1980;1990), показавших роль фазовых переходов липидов и белков цитоскелета в механизме его развития и предупреждения. Установлено, что первичным температурно-зависимым процессом, развивающимся в мембране клеток при быстром их охлаждении до 0 °C, являются фазовые переходы аннулярных липидов, утечка К+ и нарушение функции белков цитоскелета, что следует рассматривать как начальные этапы механизма температурного шока. В связи с этим клетки и субклеточные структуры авторы условно разделяют на следующие группы: во-первых, некоторые микроорганизмы (Е. Coli) и синаптосомы мозга, в мембранах которых отсутствует холестерин и температурные фазовые переходы липидов в мембранах начинаются значительно выше 0 °C; во-вторых, мембраны митохондрий и лизосом, а также клетки, мембраны которых содержат мало холестерина (5−15%). Для них характерно развитие фазовых переходов липидов в диапазоне 4−0°С; в-третьих, лимфоидные клетки и эритроциты, мембраны которых обогащены холестерином и для которых характерны фазовые переходы в липидах в зоне отрицательных температур. Отсутствие холестерина и наличие фазовых переходов липидов при пониженных температурах обусловливает высокую чувствительность клеток и внутриклеточных органелл к охлаждению в зоне низких положительных температур. Исследования динамики температурного шока показали, что в основе этого процесса лежит возникновение и формирование трансмембранных дефектов, которые обеспечивают утечку ионов и метаболитов клетки наружу.

История криобиологии выявляет существование определенной периодизации развития этой области естествознания. Если для начального периода и до начала 50-х годов нашего столетия характерно эмпирическое трактование роли низкотемпературных факторов в повреждении клеток и их защите, то последующее десятилетие характеризуется попытками разработать способы криоконсервацни большинства видов клеток и тканей животных и человека на основе научно обоснованных данных.

Согласно современным представлениям, повреждение клеток сильно зависит от количества и формы образующихся в них кристаллов льда. Вероятность же кристаллизации тесно связана с интенсивностью и степенью обезвоживания клетки. Учитывая это, П. Мейзур пришел к заключению, что для каждого типа клеток существует оптимальная, обеспечивающая максимальную сохранность биоструктур скорость охлаждения, которая настолько мала, что внутриклеточная кристаллизация не успевает развиться, однако она достаточна, чтобы свести к минимуму период экспозиции клеток в гиперконцентрированном солевом растворе, образующемся при вымораживании воды в виде чистого льда. Автор осуществил количественное описание процессов обезвоживания клетки, а также определил условия, при которых понижается интенсивность процесса внутриклеточного кристаллообразования. Работы П. Мейзура имели большое теоретическое и практическое значение для разработки эффективных способов криоконсервации клеточных суспензий.

Основоположником учения о криозащитных веществах, способных предохранять живые системы от губительного действия низких температур, является Н. А. Максимов (1912), работы которого по изучению защитных свойств растворов неэлектролитов, неорганических солей и солей органических кислот и выяснению значения зоны эвтектики защитных растворов для выживаемости клеток внесли большой вклад в науку о защитных веществах. Опыты по замораживанию различных растений выявили защитное действие сахаров, в частности глюкозы и сахарозы, одноатомных и многоатомных спиртов, из числа которых с успехом был применен глицерин, хотя его защитное действие на растительные клетки оказалось слабее сахаров. В дальнейшем эти идеи были развиты И. В. Тумановым (1940), который также указывая на роль сахаров и других компонентов в развитии синдрома морозоустойчивости растений.

Глицерин в качестве защитного вещества (9,6%) испытывали А. Д. Берштейн и В. В. Петропавловский (1937) при замораживании спермы некоторых животных и уста;

новили, что клетки в его присутствии успешно переносят охлаждение до -21°С.

В 1985 г. Брик и Бесис открыли криозащнтные свойства поливинилпирролидона (ПВП), что положило начало применению криобиологии экзоцеллюлярных криопротекторов, а в 1959 г. Дж. Лавлок указал на криопротекторные свойства диметилсульфоксида (ДМСО) — одного из наиболее широко применяемых при криоконсервацни плотных тканей и органов криопротекторов.

О. Смит (1964) подвел итоги глубокого охлаждения клеток разнообразной природы — эритроцитов, спермиев, бактерий, а также некоторых тканей, таких, как кожа. Впервые был употреблен термин «криобиология» при описании повреждающего и защитного действия низких температур на биообъекты. Приведены результаты исследований по разработке способов криоконсервировання (1948 г.) с помощью глицерина спермин животных и птиц, а также других биообъектов, нашедших практическое применение в сельском хозяйстве и других отраслях, можно считать официальной датой рождения криобиологии как науки.

Идея витрификации для долгосрочной криоконсервации яйцеклеток и эмбрионов была разработана в 1951 году доктором Крисом Погес в Кембридже, Англия. Он начал замораживать сперму цыпленка, и на деле результаты оказались очень хорошими. На самом деле, вплоть до наших дней, техники замораживания спермы для всех особей млекопитающих почти напоминают то, что доктор Погес описывал в своей публикации 1951 года в журнале «Природа». Однако при попытке использования той же техники при заморозке яйцеклеток, ученые столкнулись с большой трудностью, главным образом, из-за того, что яйцеклетка сильно наполнена водой, и при заморозке кристалл льда легко повреждает яйцеклетку.

В 1987 году доктору Биллу Ра из Национального Зоопарка Вашингтона, пришла идея быстрой заморозки, самая первая идея витрификации. Он испытал технику быстрой заморозки на мышиных яйцеклетках, и были получены удивительные результаты. Доктор Джон Занг начал работать с доктором Ра в 1991 году при попытке заморозить человеческие яйцеклетки. Однако из-за ограниченности источников человеческих яйцеклеток проект был остановлен в самом начале. Со стороны доктора Ра из-за недостатка капитала целый проект был завершен, даже несмотря на то, что идея использования техники витрификации для заморозки яйцеклеток от находящихся под угрозой особей представляла большой интерес. Примерно в 1993 году доктор Каваяма из Японии отправился в Данию, чтобы возобновить идею витрификации с яйцеклетками от, по большей части, коров и быков. После многих лет исследований витрификация, наконец, стала успешной. В 2003 году в США при использовании данной техники родился первый живорожденный ребенок. В 2005 году прошли первые роды с живым рождением детей (фактически это была двуплодная беременность) с помощью витрификации яйцеклетки на восточном побережье и на территории Нью-Йорка.

На сегодняшний момент наука не стоит на месте, методы криоцервации и витрифакации модифицируются из года в год, с каждым раз продвигаясь все дальше.

2. Криопротекторы

Вещества, способные предотвращать развитие повреждений биологических объектов при их замораживании и последующем отогреве, называют криопротекторамн. К эффективным криопротекторам относятся соединения, принадлежащие к разным классам химических соединений: спиртам (этиленгликоль, а-пропилен гликоль, глицерин), амидам (диметилацетамнд), оксидам (диметилсульфоксид) и искусственным полимерам (поливинил пиррол и до и, оксиэтилированнын крахмал, полиэтнленгликоль). Приведенный список не исчерпывает ни классов веществ, в которых могут встретиться эффективные криопротекторы, ни перечня криопротекторов в названных классах. Имеющаяся классификация А. Кэроу включает довольно большое число веществ, однако большинство из них оказались неэффективными крпопротекторами.

По способности криозащитных соединений проникать внутрь клетки все известные криопротекторы, по предложению Лавлока (1954), разделяются на экзо-, эндоцеллюлярные (непроникающие, проникающие) и криопротекторы смешанного типа. К числу проникающих криопротекторов относятся прежде всего представители однои многоатомных спиртов, оксиды, некоторые из ннзкомолекулярных сахаров (например, глюкоза). Криопротекторы типа амидов кислот, высокомолекулярных сахаров, белков, высокомолекулярных полиэтнленоксидов и гликолей, ПВП, ГЭК принадлежат к числу непроникающих соединений. Некоторые виды криопротекторов, например ПЭО, могут в своем составе содержать определенную долю мономерных фракций, которые проникают внутрь клетки, в то время как основная масса полимера остается во внеклеточной среде. Такого типа соединения могут быть причислены к криопротекторам смешанного типа.

Характерно, что для криопротекторов различной химической природы не существует единых границ молекулярной массы, так как криопротективная активность обнаруживается как у, низкомолекулярных веществ (например, ДМСО, глицерин), так и у высокомолекулярных соединений (например, ГЭК, ПЭГ). Полимерные соединения с учетом данных о криозащнтных, реологических свойствах и, особенно, токсичности имеют оптимальные пределы величин молекулярной массы: для ПЭО — 100−1500; для ПВП — 12 500−25 000; для ГЭК — 250 000−500 000.

Эффективный, проникающий внутрь криопротектор должен обладать следующими свойствами: быть нетоксичным, хорошо растворяться в воде и растворах электролитов, снижать количество вымораживаемой в виде чистого льда воды прн каждой данной температуре и полностью предотвращать кристаллизацию воды из эвтектической смеси «криопротектор — вода». При этом он должен поддерживать в растворенном состоянии соли и белки вплоть до эвтектического перехода в аморфное состояние, т. е. его растворы должны иметь низкую эвтектическую температуру, чтобы сократить температурный интервал воздействия твердой фазы на клетку в процессе замораживания и отогрева. Однако в реальных условиях некоторые из криопротекторов, обладая низкой эвтектической температурой, не могут быть использованы из-за своей токсичности.

Общими свойствами криопротекторов является наличие в их структуре полярных молекул, способных взаимодействовать как с молекулами воды, металлами и солями, так и с компонентами мембран и биополимерами. Важным свойством криопротекторов является также их способность влиять на процессы кристаллизации, способствуя формированию мелкокристаллического льда, который по обладает енлышмн полями напряжения. Изменение структуры льда иод влиянием криопротекторов снижает степень механического воздействия на цитоплазматическне структуры и мембраны.

Поэтому вязкость криопротекторного раствора при низкой температуре должна быть высокой, чтобы при замораживании в микроканальцах, где концентрируются клетки, раствор переходил в аморфное состояние при относительно низких концентрациях криопротектора и солей. Непременным требованием к такого рода криопротекторам является их способность быстро проникать в клетку и легко удаляться из нее с тем, чтобы уменьшить осмотические эффекты при замораживании и отмывании криопротектора. В присутствии криопротектора вымораживание фракции воды из криозащитной среды протекает в широкой температурной зоне и завершается, когда концентрация невымерзшей воды достигает величин 20−30%. При увеличении исходного (до замораживания) содержания, криопротектора в. среде связывание солей и других веществ увеличивается, что препятствует их концентрированию до критических, губительных для клетки величин. Следовательно, в присутствии криопротекторов соли либо вообще не концентрируются до повреждающих пределов, либо эти пределы достигаются в зоне температур, когда развитие повреждений протекает медленно.

По мере вымораживания воды из криозащитной среды растворы криопротекторов становятся гипертоническими, что: вызывает обезвоживание клетки. В результате частичной дегидратации клетки концентрация внутриклеточных коллоидов повышается, что способствует переохлаждению внутриклеточной среды и ее частичному переходу в стеклообразное состояние, исключающее образование достаточно крупных для повреждения клеток кристаллов льда.

Быстрое проникновение криопротектора в клетку в составе гипертонических криозащитных сред по мере вымораживания воды и обезвоживания клетки предупреждает возникновение на мембране повреждающих градиентов концентраций внеи внутриклеточного раствора.

Экзоцеллюлярные криопротёкторы (ПВП, ГЭК, ПЭГ, сахара) оказывают защитной действие благодаря способности вызывать, частичную дегидратацию клетки и тем самым снижать возможность внутриклеточной кристаллизации. Действительно, действие непроннкающих в клетку криопротекторов намного сложнее, и оно реализуется, очевидно, через определенные рецепторные и ионотранспортирующие макромолекулярные комплексы мембран, которые влияют на структурно-функциональное состояние белков цитоскелета. В результате осмотического сжатия клеток они частично дегидратируют и в таком состоянии способны выдерживать замораживание.

Защитные свойства глицерина. Благодаря наличию ОН-групп глицерин способен формировать водородные связи с молекулами воды и смешиваться с ней в любых соотношениях.

При замораживании чистый глицерин очень редко затвердевает, но иногда кристаллизуется в виде кристаллов ромбовидной формы. На кристаллизацию глицерина влияют вода либо другие примеси. Глицерин обладает высокой вязкостью, связанной с наличием в его молекуле гндроксильных групп, вследствие чего в его присутствии образуется пространственная сетка водородных связей, плотность которых в 3 раза больше, чем одноатомных спиртов. С повышением концентрации глицерина вязкость водно-глицериновой смеси увеличивается, при этом снижаются скорость движения молекул растворенного вещества и их кинетическая энергия, что приводит к снижению скорости физико-химических процессов в биологических объектах. При взаимодействии с водой глицерин разрушает ее ледоподобный каркас, однако при этом формирует гидратную оболочку вокруг молекул воды. Формирование такой оболочки способствует стабилизации гидратационных решеток белков за счет перехода молекул свободной воды в связанное состояние.

Температура замерзания водного раствора глицерина зависит от его концентрации: наиболее низкой температурой замерзания (-46,4°С) обладает 66,7%-й раствор глицерина. Переход такой вязкой жидкости в витрифицованное состояние происходит при температуре ниже — 83 °C. Витрификация растворов глицерина увеличивается с повышением концентрации его в среде замораживания. Важно, что в присутствии глицерина формируется мелкозернистый лед, который переходит в аморфное состояние. При мелкокристаллическом замерзании растворов центры кристаллизации хотя и очень многочисленны, но не способны к росту.

К числу положительных эффектов глицерина следует отнести также его способность уменьшать размер кристалла льда, поскольку его охлаждение сопровождается сжатием объема, что способствует снижению давления водного льда. Свойство глицерина сжиматься при замерзании является существенным, так как превращение воды в лед не сопровождается увеличением его объема. Защитные свойства глицерина связаны также с его способностью поддерживать переохлажденное состояние клетки, поскольку его молекулы образуют стабильные водородные связи с Н20. Тем самым он уменьшает количество Н" 0, способной кристаллизоваться, и повышает долю воды, связанной с белками и другими биополимерами.

Под защитой глицерина криоконссрвируют разнообразные биологические объекты: вирусы, микроорганизмы, клетки и ткани. Существует очень много комбинаций консервирующих сред, включающих глицерин, которые также широко применяются для замораживания биообъектов.

Различные клетки и ткани неодинаково реагируют на действие глицерина. Например, проницаемость плазматической мембраны при 0 °C для глицерина у некоторых типов клеток очень снижена, и в этом случае глицерин действует уже как экзоцеллюлярный криопротектор. При обычных температурах (22−37°С) глицерин легко проникает в клетки и, действуя как противосолевой буфер, защищает мембрану и внутриклеточные структуры от действия «эффектов раствора» и, кроме того, уравнивает осмотическое давление по обе стороны мембраны, т. е. предупреждает развитие осмотических градиентов на мембране. Криозащита с помощью глицерина эффективна еще и потому, что он формирует комплексы с солями и металлами, а также активными центрами ферментов, вызывая временную блокаду функциональной активности ряда ферментных систем в клетке. Торможение структурно-функциональной активности клеток при взаимодействии с глицерином либо другим криопротектором, которое приводит к подавлению метаболической активности клеток, в литературе получило название псевдотоксического эффекта. Этот «псевдотоксический» эффект полностью устраняется при удалении глицерина из клетки. В медицинской практике глицерин применяется как препарат осмотического действия. Наибольшая переносимая доза глицерина при внутривенном введении составляет: человеку — 1−2 г./кг массы, собакам — 3−5, кроликам — 2−3 г./кг массы.

Поливинилпирролидон (ПВП) относится к классу искусственных полимеров. Растворы ПВП обладают высокими адсорбционными свойствами к воде и различным веществам, способностью комплексообразования по отношению к лекарственным препаратам, токсинам, красителям и солям. Поэтому ПВП в композиции с различными препаратами, особенно антибиотиками и гормонами, способствует их пролонгированному действию в организме. В медицинской практике препараты ПВП используют в качестве плазмозаменителя. Для этого применяют препараты со средними м. м. (12−40 кД), так как крупные молекулы ГВП плохо выводятся из организма.

Молекулы ПВП представляют собой дифильные соединения, т. е. обладают гидрофильно-гидрофобными свойствами. В водных растворах молекулы этого соединения принимают хаотичную спиральную конфигурацию, что позволяет им гидратировать достаточное число молекул Н2О. Например, одна молекула ПВП гидратирует 3,3 ммоль Н20. В силу хорошо развитых гидратационных свойств ПВП характер замораживания растворов изменяется — процесс кристаллизации смещается в более низкотемпературную область.

Гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) — соединение, получаемое в результате оксиэтилировання водорастворимой фракции крахмала, представляет собой полидисперсную систему, охватывающую довольно широкий диапазон М. м. (250−500 кД). Растворы ГЭК формируют водородные связи с водой и стабилизируют ее решетку. При этом структурированность воды изменяется, и в процессе замораживания повышается способность ее молекул формировать аморфные кристаллы льда. Растворы ГЭК также оказывают стабилизирующее влияние на плазматическую мембрану клеток, однако механизм этого взаимодействия остается неисследованным. При охлаждении растворов ГЭК формируются мелкоячеистые структуры концентрического характера, напоминающие структуры, возникающие при замораживании ПВП. ГЭК считается биологически инертным препаратом, поэтому его используют в качестве плазмозаменителя, гемостатического препарата или разделителя форменных элементов крови.

Механизмы взаимодействия криопротекторов с искусственными и природными мембранами до конца не изучены. Многие вопросы, касающиеся характера и природы молекулярных перестроек белков и липидов мембран, остаются неясными. В частности, отсутствуют данные о влиянии криопротекторов на состояние гликокаликса — поверхности клетки, на белки цитоскелета и различные системы внутриклеточной сигнализации. Сравнительно мало данных о характере взаимодействия криопротекторов с ядерным материалом клетки и об участии их в изменении экспрессии генов в условиях осмотически-температурного стресса.

3. Перспективы применения метода витрификации в медицине

На данный момент витрификацию в криобиологии понимают как сверхбыстрое замораживание живых объектов. При использовании метода сверхбыстрого замораживания криопротекторный раствор, в котором находятся живые объекты, не кристаллизуется при охлаждении, а переходит в стекловидное состояние.

Наиболее часто и успешно витрификацию используют для криоконсервации ранних (преимплантационных) эмбрионов человека, лабораторных и сельскохозяйственных животных. В этом случае говорят о «витрификации эмбрионов». Также, на данное время, проводят витрификацию сперматозоидов и ооцитов, что помогает бороться с бесплодием.

В медицинской практике гипотермические методы широко используются для кратковременного консервирования клеток, тканей и особенно органов (почка, печень).

Нельзя не отметить, что замораживание и длительное сохранение различных штаммов микроорганизмов, широко применяются для получения ценных продуктов в микробиологической промышленности, используемых в медицинской, пищевой и других отраслях народного хозяйства.

Возможно, за витрификацией стоит будущее. Ученые не теряют надежды, что в когда-нибудь глубокое замораживание человека с последующим оживлением вполне реально. Это будет осуществимо тогда, когда ученые научатся проводить моментальное замораживание: температура тела должна понизиться почти на сотню градусов за сотые доли секунды. При этом тело человека превратится в стеклообразную массу и станет полупрозрачным. Молекулы белков при этом не поменяют своей структуры, при размораживании белки вернутся в первоначальное состояние. На данный момент ученые не располагают столь мощной техникой для мгновенного замораживания.

Вывод

Изучив витрификацию и познакомившись с криоконсервацией, становится ясно, что это научное направление еще молодо и многое остается под большим вопросом. Но, несмотря настоль юный возраст, они претерпели большой прогресс, особенно в наше время.

Сейчас возникает много вопросов этического характера, относительно криоконсервации эмбриона человека, а также использования сперматозоидов и ооцитов в репродуктивно-воспомогательной технологии. Может ли человек вмешиваться в цикл жизни человека, в его судьбу? А с вопросом полного замораживания человека возникает споров еще больше. Возможно, что на этом неплохо наживаются мошенники, которые предлагают за огромные суммы заморозить человека за десятки лет.

1. Белоус, А. М. Криобиология. / В. И. Грищенко. — Киев: Наука думать, 1994. — 40−51 с.

2. Гаврилов, Л. А. Биология продолжительности жизни. / Н. С. Гаврилова. — Л.: Наука, 1991. — 46−48 с.

3. Голдовский, А. М. Анабиоз: монография. — Л.: Наука, 1981. — 108−115 с.

4. Лозина-Лозинский, Л. К. Очерки по криобиологии. — Л.: Наука, 1972. — 200−203 с.

5. Эттингер. Р. Перспективы бессмертия. — М.: Научный мир, 2003. — 98−104 с.