Методы определения и оценка ГМО

Так как возможность появления отдельных изменений в метаболизме растений теоретически может предполагаться, во всем мире признана необходимость тщательной оценки этой продукции на биобезопасность.

Существует три направления по проведению комплексной санитарно — эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной из ГМИ: оценка медико-генетическая, медико-биологическая и оценка технологических параметров.

Медико-генетическая оценка. Медико-генетическая оценка (основанная на применении полимеразной цепной реакции — ПЦР) включает анализ вносимой последовательности генов, маркерных генов, промоторов, терминаторов, стабильности и уровня выраженности генов. Медико-биологическая оценка состоит из нескольких блоков исследований: композиционная эквивалентность, хроническая токсичность, специальные исследования (аллергенные свойства, влияние на иммунный статус, репродуктивную функцию, мутагенность, канцерогенность, нейрои генотоксичность). генетический модифицированный продукт трансгенный.

Технологическая оценка. Технологическая оценка определяет органолептические и физико-химические свойства, а также влияние генетической модификации на технологические параметры продукции.

Получив трансген, в первую очередь оценивают так называемую композиционную эквивалентность с его традиционным аналогом — есть ли отличие в химическом составе (включая белковый, кислотный, аминокислотный, витаминный, минеральный состав и пр.). Это нужно еще для того, чтобы определить весь необходимый набор дальнейших исследований. Далее начинается изучение содержания как природных, так и антропогенных контаминантов (тяжелые металлы, пестициды, остатки микотоксинов и др.).

После исследования абсолютной композиционной эквивалентности изучению подвергается собственно измененный белок, кодируемый измененным геном. Он выделяется в достаточном количестве и, прежде всего, проверяется на токсичность и аллергенность. При их отсутствии белок считается безопасным, регистрируется и разрешается к использованию для пищевых целей. Далее изучается и оценивается пищевая ценность продукта. Совокупность всех этих данных позволяет регистрировать продукт и продолжать пострегистрационный мониторинг, исследования по фактам накопления новых данных.

Для оценки аллергенного потенциала продуктов-трансгенов обязательно проводят так называемые острые оральные эксперименты, в которых лабораторным или сельскохозяйственным животным в течение определенного срока скармливают анализируемый протеин в дозах, значительно превышающих его содержание в растительных тканях (до 5 г на кг живого веса животного), а затем выявляют у животных мельчайшие отклонения в здоровье по сравнению с контрольной группой, не принимавшей этот белок. Вообще при оценке токсичности веществ (не только белков) также принимают во внимание данные о накоплении их остатков, кумулятивные эффекты, общую экспозицию (продолжительность и способ действия: через кожу, при вдыхании, при поедании), пороговые и эндокринные эффекты, чувствительность к ним представителей разных возрастных групп населения и др.

В настоящее время широко принято делить ГМ — продукцию на три категории. Первая — это продукты, композиционно абсолютно аналогичные традиционным (по молекулярным и фенотипическим характеристикам, уровням содержания ключевых нутриентов, антиалиментарных, токсичных веществ и аллергенов, характерных для данного вида продукта или определяемых свойствами переносимых генов). Они, как и аналог, безопасны и, соответственно, как аналог не требуют никаких дополнительных исследований. Большинство выращиваемых ныне в коммерческих целях ГМ — растений относятся именно к первой группе.

Вторая — ГМ — продукция, имеющая определенные различия, связанные с введением нового гена, синтезом нового белка. В этом случае исследования концентрируются именно на этом белке, на характеристике его свойств.

И, наконец, в будущем возможно появление продуктов с намеренно измененным композиционным химическим составом (витаминным, белковым), тогда, конечно, потребуются другие исследования. В качестве путей решения предлагается использовать новые направления современной науки — геномику, протеомику и метаболомику.

Разработка специальных аналитических методов началась в 1994;1995 гг. одновременно с созданием первых разрешенных для реализации продуктов из ГМИ. В большинстве случаев в своем составе они содержат материал, встроенный в геном растения (рекомбинантную ДНК), а также определяющий заданное генетической модификацией свойство — белок. Количество последнего фиксируют иммунологическими способами, такими, как «Вестерн блоттинг» или непрямой твердофазный иммуноферментный тест (новый белок, выступающий в роли антигена, обнаруживают с помощью соответствующих антител, конъюгированных с ферментом). Эти методы наиболее просты в исполнении, относительно дешевы, чувствительность их 0,5−1,0% содержания белка, определяющего новый признак, к общему количеству белка. Но если исходное сырье подвергают глубокой технологической обработке, разрушающей белок (высокая температура, кислая среда, использование ферментов и др.), то иммунологический анализ дает нестабильные или плохо воспроизводимые результаты. Скажем, неприменим такой подход при исследовании колбасных и кондитерских изделий, детского питания, биологически активных добавок.

Следует также подчеркнуть, что концентрация белка, формирующего новый признак (например, устойчивость к колорадскому жуку в картофеле или пестицидам в сое), в большинстве генетически модифицированных растений, представленных на мировом продовольственном рынке, меньше 0,06%, что значительно ниже чувствительности описанного метода. Поэтому предпочтительнее другой способ — поиск в продукте рекомбинантной ДНК.

Строение этой молекулы одинаково во всех клетках организма, значит, любая часть растения пригодна для анализа. Кроме того, ДНК стабильнее белка и сохраняется после технологической и кулинарной обработки продуктов. В основе метода — полимеразная цепная реакция, изобретенная американцем К. Мюллисом в 1983 г. Она произвела революционный переворот в молекулярной генодиагностике. Суть ее: для распознавания определенного участка ДНК, присутствующего только в модифицированном геноме, прибегают к специальным маркерам — последовательностям ДНК, именуемым праймерами. По завершении идентификации выявленный фрагмент молекулы многократно копируется с помощью термостабильного фермента ДНК-полимеразы. Последний этап — электрофорез в агарозном геле. Наличие полосы в соответствующем участке электрофореграммы и означает присутствие искомой ДНК.

Кроме гена, кодирующего определенный белок, в модифицированную ДНК встраивают так называемый промотор, запускающий транскрипцию, и терминатор, ее останавливающий. На сегодня 98% всех ГМИ пищи растительного происхождения, представленных на мировом продовольственном рынке, содержат в геноме либо промотор 35S, получаемый из вируса мозаики цветной капусты, либо терминатор NOS из бактерии Agrobacterium tumefaciens, либо обе названные последовательности ДНК. Это обстоятельство значительно упрощает и ускоряет их поиск, когда надо проверить наличие ГМИ в большом количестве образцов.

Однако такой анализ фиксирует лишь факт использования генетически модифицированной культуры при производстве продукта. И при положительном результате необходимо выяснить, прошли ли они соответствующую экспертизу на безопасность и регистрацию, т. е. разрешены ли они для питания. Тогда применяют полимеразную цепную реакцию с использованием праймеров, распознающих конкретную генетическую конструкцию, встраиваемую в геном. Способ заявлен в качестве стандартного для идентификации ГМИ растительного происхождения в 23 странах и позволяет определить рекомбинантную ДНК в пищевых продуктах, даже если ее содержание в них не превышает 0,9% от общего количества ДНК трансгенного растения, используемого при производстве.

Но и у этого способа есть ограничения, поскольку не все пищевые продукты имеют в своем составе ДНК. К таким относятся прошедшие глубокую технологическую обработку рафинированные растительные масла, сахарный песок, крахмалы высокой степени очистки, соусы, этиловый спирт (контролируют их на основании специальных документов, сопровождающих продукт от поля до прилавка).

Благодаря высоким темпам развития биотехнологии количество создаваемых ГМИ пищи будет расти. И необходимость выявлять в них огромное количество новых генетических конструкций приведет к значительному увеличению времени проведения анализа полимеразной цепной реакции и его стоимости. Поэтому уже сегодня ведется поиск новых подходов к ведению контроля. Весьма перспективны в этом плане технологии с применением биологических микрочипов, своеобразного автоматизированного комплекса методов аналитической лаборатории, перенесенного на маленькую поверхность стекла или пластика. Основываясь на принципе гибридизации молекул ДНК, фиксированных на поверхности чипа, с искомым аналогом исследуемой пробы и последующего измерения флуоресценции, биочип определяет сотни (!) сортов генетически модифицированных растений в одном анализе. Правда, пока эту технологию применяют в основном для научных целей. Но первые шаги к внедрению ее в область контроля за пищевой продукцией из ГМИ уже сделаны. Так, в Российской Федерации разработан и включен в число национальных стандартов метод выявления следующих генетических последовательностей: промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты, маркерного гена gus из бактерии E.coli, терминаторов nos и ocs из бактерии Agrobacterium tumefaciens, маркерного гена npt II бактериального происхождения.

Если же модификация направлена на изменение химического состава продукта (таких, разрешенных для питания, пока единицы), применимы и специальные методы исследования: хроматография, спектрофотометрия, спектрофлюориметрия и др. Скажем, линии сои G94−1, G94−19, G168 фирмы Дюпонт (США) имеют измененный жирнокислотный состав: сравнительный анализ показал увеличение содержания олеиновой кислоты в бобах до 83,8%, в то время как в традиционном аналоге ее всего 23,1%. Газовая хроматография выявляет данную генетическую модификацию даже в рафинированном соевом масле, не содержащем ДНК и белка.

Для количественного определения ГМИ наиболее перспективна полимеразная цепная реакция с детекцией результатов в режиме реального времени. В чем же суть метода? С помощью специального оборудования, позволяющего наблюдать за кинетикой процесса, в реакционную смесь вноситься дополнительный маркер — участок ДНК, комплементарный искомому аналогу и содержащий флуоресцентную метку, интенсивность флуоресценции которой в ходе реакции пропорциональна количеству ГМИ в исследуемом продукте. Такой анализ проводится в закрытой пробирке, занимает совсем немного времени, а итог виден на компьютерном мониторе.