Экспресс-диагностика холеры. 
Экспресс-диагностика особо опасных инфекций

Холеру вызывают два биовара Vibrio cholerae. Один из них, выделенный Кохом в Египте в 1883 году, назвали классическим, другой, полученный Ф. Готшлихом на карантинной станции Эль-Тор в Северной Африке в 1906 году — V.eltor. оба биовара неагглютинирующиеся вибрионы (НАГи), галофильные парагемолитические вибрионы, продуцирующие гемолизин, и нехолерные вибрионы-кислотообразователи включены в род Vibrio семейства Vibrionaceae.

Это острая кишечная инфекция, сопровождающаяся резким обезвоживанием и обессоливанием организма. Источником инфекции является человек — больной или носитель. Механизм передачи фекально-оральный.

Возбудители имеют соматический Ои жгутиковый Н-антигены. О-антиген обладает видовой и типовой специфичностью. По строению О-антигена различают долее 40 сероваров. Развивающийся к холере иммунитет носит гуморальный характер.

Материал для исследования: испражнения, рвотные массы, трупный материал.

Метод массового исследования на вибриононосительство. Материал берется непосредственно из кишечника при помощи стеклянной трубочки диаметром 0,5 см (для детей), 1,5 см (для взрослых) и длиной 15 см с оплавленными концами (при отсутствии трубочек используют ватные тампоны на деревянных палочках). Трубочку немедленно погружают во флакон, содержащий 100 — 200 мл 1% пептонной воды и агглютинирующую холерную О-сыворотку в разведении до половины ее титра. В один и тот же флакон берут материал от 10 лиц. Флаконы помещают в термостат при 37⁰С. Через 3 — 4 часа холерные вибрионы начинают агглютинироваться и постепенно (в течение ближайших 2 часов) падают в виде хлопьев на дно флакона. Исследуя под микроскопом окрашенные мазки и «висячую каплю», обнаруживают склеившихся и частично свободных вибрионов. Через 6 часов дается ответ и в случае обнаружения холерных вибрионов немедленно производится посев индивидуально от каждого из 10 лиц. Такой метод дает возможность исследовать до 16 000 человек за 3 — 4 дня.

Метод иммунодиагностической микропленки. Изучение антигенных свойств холерных вибрионов проводят путем постановки пробирочной или пластинчатой реакции агглютинации с использованием сухих лиофилизированных диагностических агглютинирующих холерных 0-сывороток и сывороток Огава и Инаба. Сыворотку разводят в физиологическом растворе или дистиллированной воде и смешивают при постановке агглютинации на стекле с исследуемой культурой вибрионов. При подготовке сыворотки используется дополнительная посуда, что усложняет работу бактериолога, а в оставшейся разведенной сыворотке быстро прорастает бактериальная микрофлора и инактивирует ее.

Для изучения антигенной структуры холерных вибрионов были разработан иммунодиагностический препарат в виде микропленок разового применения, который обладал достаточной специфичностью, демонстративностью и экономичностью. Иммунодиагностические холерные микропленки (ИХМП) в виде полимерной пленки с нанесенными высушенными каплями, фиксированными на бумаге, содержат минимальное количество сыворотки, пленкообразующий компонент и консервант. Пленкообразующий компонент связывает, склеивает и фиксирует микроколичества ингредиентов к поверхности носителя, исключает крошение микропленок; консервант предохраняет препарат от разрушения при длительном хранении.

Концентрация диагностической сыворотки в ИХМП является достаточной, поскольку после эмульгирования в капле физраствора, антитела содержатся в титре 1:100, что полностью обеспечивает ход реакции. Тем самым обеспечивается достаточная концентрация антител, снижается, расход диагностической сыворотки и исключается возможность ее неиспользования. При этом создаются условия для быстрого растворения ИХМП, контакта ее с холерными вибрионами и проведения реакции непосредственно на полимерной пленке.

Готовые ИХМП хранят в темном сухом месте при 4— 7 °C в картонных коробках (срок годности 3 года — срок наблюдения) и по мере надобности ИХМП используют для определения холерных вибрионов. Для исключения случайного заражения окружающих предметов ИХМП помещают в чистую чашку Петри. На поверхность ИХМП наносят каплю физиологического раствора, в которой растворяют ее. Разведенную сыворотку смешивают с изучаемой культурой вибрионов, снятой бактериологической петлей с питательной среды. При другом варианте постановки реакции ИХМП снимают скальпелем с бумажной подложки и переносят на предметное стекло, растворяют в капле физиологического раствора и смешивают с изучаемой культурой вибрионов.

При положительной реакции через 1—3 мин появляются зерна агглютината, окрашенные в зеленый цвет, а капля просветляется. При отрицательной реакции капля остается гомогенно-мутной.

Использованную часть полимерной пленки отрезают, а оставшуюся часть пленки с ИХМП сохраняют в той же чашке Петри для дальнейших исследований. Использование ИХМП в исследованиях вибрионов и других микроорганизмов позволяет получить статистически достоверные результаты, сэкономить дорогостоящие диагностические сыворотки, повысить качество и эффективность исследований.

Реакция агглютинации микрометодом. В последнее время в бактериологической практике нашел довольно широкое применение микрообъемный метод постановки серологических реакций с использованием специальных планшеток и микротитровальных игл .

Реакции агглютинации микрометодом ставят с холерными агглютинирующими референс-сыворотками в полистроловых микротитровальных планшетках с плоским или V-образ-ным дном, предназначенных для иммунологических реакций, используются мпкротитровальные планшетки с объемом лунок 0,4 мл и в пробирках параллельно. Предварительно планшетки тщательно промывfют проточной водой, каждую лунку прополаскивали дистиллированной водой и хорошо просушивали, затем делали надписи простым карандашом.

Во все лунки четырех рядов пипеткой-капельницей из микротитратора Такачи вносят 0,85% раствор хлористого натрия (рН 7,2) в объеме 0,05 мл, затем в первую лунку каждого ряда — того же объема соответствующей сыворотки в разведении 1:25 и проводят ее титрацию микротитроваль-ной иглой с головкой (объем 0,05 мл), удаляя из последней лунки по 0,05 мл.

После титрации сывороток во все лунки, кроме их контролей, вносят 0,05 мл взвеси исследуемой агаровой культуры. Эту манипуляцию проводят на подносе.

По окончании титрации планшет накрывают крышкой и ставят на подносе в термостат при 37° С. После 2-часовой экспозиции проводят окончательный учет реакции под стереомикроскопом (МБС-1, МБС-2) в косопроходящем свете. При учете реакции крышку с планшетки не снимают, в случае ее запотевания заменяют другой.

После учета реакции планшетку и крышку складывают в кювет и заливают 5'% хлорамином так, чтобы все лунки планшетки были заполнены дезраствором.

Исследования показали, что все холерные вибрионы классического и эльтор биоваров агглютинируются холерной видовой 0-сывороткой в микрообъемах.

Что касается агглютинабельности типоспецифическими сыворотками, то прослеживается следующая закономерность:

при постановке с сывороткой Инаба в микрометоде агглютинировались 100, а в пробирках—90% штаммов классического холерного вибриона серовара Инаба. Холерные вибрионы биовара эльтор серовара Инаба агглютинировались в планшетках и пробирках соответственно в 95 и 96% случаев. У холерных вибрионов классического и эльтор биоваров серовара Огава соотношения в обеих методиках были практически те же.

Интересен факт, что при постановке реакции агглютинации с RO-сывороткой наибольшее число штаммов, агглютинирующихся RO-сывороткой до титра, было выявлено в микрометоде; в пробирках агглютинация установлена у одного штамма.

Все штаммы вибрионов 040—056 сероваров в микрометоде не агглютинировались холерными агглютинирующими сыворотками, а в пробирках штамм II 258−1099 (040 серовара) агглютинировался всеми холерными сыворотками.

Большинство изученных штаммов представителей семейства Enterobacteraceae также не агглютинировалось холерными агглютинирующими сыворотками, за исключением Sh. flexneri 2503, у которого в пробирках была выявлена агглютинация со всеми сыворотками, и штамма S. typhimurium 21, у которого отмечена неспецифическая реакция агглютинации со всеми сыворотками как в пробирках, так и в планшетках.

При пользовании этим методом расход агглютинирующих сывороток уменьшается в 10 раз, значительно сокращается время, необходимое для постановки реакции, и ускоряется срок выдачи ответа. Кроме того, описанный метод менее трудоемок. Таким образом, стандартность, достоверность полученных результатов, высокая экономичность метода позволяют рекомендовать его при идентификации холерных вибрионов, изучении штаммов и популяции штаммов холерных вибрионов по признаку агглютинабельности.

А также:

Иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и типовыми холерными фагами. Капли испражнений или материала с поверхности пептонной воды обрабатывают холерной О-сывороткой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты «раздавленная капля», которые исследуют с помощью темнопольной и фазовоконтрастной микроскопии. В положительном случае через 3−5 минут движение вибрионов прекращается.

РИФ. Препараты из исследуемого материала обрабатывают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном микроскопе.

Положительным результатом считается обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто-зеленым свечением в виде блестящего ободка по периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1−2 часа после начала исследования при концентрации вибрионов не менее 10⁶ клеток в 1 мл., поэтому рекомендуется предварительно подращивание материала на питательных средах.