Суспензионные культуры. 
Суспензионные культуры

Суспензионные культуры

Суспензионные культуры — отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко подвергнуть воздействию химических веществ.

Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.

Признаком «хорошей» линии служит способность клеток к перестройке метаболизма и и высокая скорость размножения в конкретных условиях культивирования. Морфологические характеристики такой линии:

• · высокая степень дезагрегации (5−10 клеток в группе);
• · морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);
• · отсутствие трахеидоподобных элементов.

Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой.

Рост суспензионных культур клеток можно оценивать по одному или нескольким следующим параметрам:

• 1. Объем осажденных клеток (ООК).
• 2. Число клеток.
• 3. Сырая и сухая масса.
• 4. Содержание белка.
• 5. Проводимость среды.
• 6. Жизнеспособность клеток.

Для работы с суспензиями необходимо знать их характеристики: жизнеспособность, плотность клеток в суспензионной культуры, степень агрегированности, скорость роста.

Жизнеспособность клеток определяют по их окраске красителем (метиленовая синь или синь Эванса). Живые клетки не окрашиваются красителем так, как клеточные мембраны непроницаемы для него. В мертвые клетки краска легко проникает, и они окрашиваются в синий цвет. Отличительная особенность суспензионных культур клеток растений — высокая плотность, необходимая для роста. Поэтому другим осложнением при культивировании клеток растений является увеличение вязкости, со провождающее рост биомассы. Это ведет к адгезии. Адгезия (прилипание) клеток друг к другу, на поверхностях культурального сосуда и погруженных в него мешалок и датчиков вызывает затруднения. В верхней части сосуда постепенно может образовываться пена, состоящая из выделяемых клетками белков и полисахаридов. В процессе культивирования клетки слипаются и часть из них скапливается в этой пене, образуя «корку», или «безе». С увеличением биомассы клеток увеличивается и эта «корка», снижая интенсивность перемешивания, что в конце концов может привести культуру к гибели.

Конечно пассаж культивирования клеточной суспензии составляет 14−16 дней. За это время плотность возрастает от 5104 до 5106 кл / мл.

Суспензию клеток можно получить из каллуса, поместив его в жидкую питательную среду с автоматическим перемешиванием. Используя фермент, например пектиназу, получаем суспензионную культуру непосредственно из ткани экспланта (лист, стебель, корень и т. д.). Вначале на поверхности экспланта образуется каллусная ткань, а затем уже от нее отделяются клетки и клеточные агрегаты, в результате чего получается клеточная суспензия. Для получения 100 мл клеточной суспензии необходимо 2—3 г свежей каллусной ткани.

Необходимым условием культивирования клеточных суспензий является постоянное перемешивание или встряхивание среды. Если клеточная суспензия находится в неподвижном состоянии, то деление суспензионных клеток приводит к образованию каллусной ткани. Деление суспензионных клеток поддерживается при наличии ауксинов и цитокининов, т. е. тех гормонов, которые необходимы для индукции и роста каллусных клеток. Таким образом, суспензионные культуры представлены типичными каллусными клетками, обладающими всеми свойствами, характерными для клеток такого рода. Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, получаемого на средах с 2,4-Д Исключение из питательной среды ионов кальция облегчает суспендирование. Еще более облегчает этот процесс добавление в среду фермента пектиназы, который разрушает пектат кальция, склеивающий отдельные клетки. Клеточные суспензии в биотехнологии используются для получения вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными лекарственными препаратами, для промышленного выращивания клеточной биомассы и для клеточной селекции. Наряду с этим, суспензии клеток можно применять в качестве исходного материала для получения изолированных протопластов. При использовании суспензионных культур в качестве продуцентов вторичных веществ применяют закрытые или открытые системы ферментов в периодическом или проточном режимах выращивания клеток.

Качество суспензии зависит от степени агрегированности ее клеток. Агрегаты не должны содержать более 10—12 клеток. Поэтому, чтобы избавиться от крупных агрегатов, суспензии фильтруют через марлевые, нейлоновые или металлические фильтры. Одновременно это позволяет освободиться от остатков экспланта или плотных кусков каллусной ткани.

Суспензионные культуры могут быть не только источником ценных вторичных метаболитов, но в них выявлены также новые необычные соединения, например, камптотецин, харрингтонин и другие антиканцерогены, пептиды (ингибитор протеаз, ингибитор фитовирусов) и др. Следует отметить, что деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных метаболитов достигает максимума в стационарной фазе роста.

Качество суспензии зависит от степени агрегированности ее клеток.

Агрегаты не должны содержать более 10−12 клеток. Для удаления крупных агрегатов суспензии фильтруют через марлевые, нейлоновые или металлические фильтры. Одновременно это позволяет избавиться от остатков эксплантаты или плотных кусков каллусных ткани.

Для глубинного культивирования растительных клеток применимы способы, разработанные в микробиологии. Различают два вида систем культивирования: открытую и закрытую.

Для закрытой системы характерен периодический режим выращивания. Клеточная масса (инокулят) помещается в определенный объем среды. Система закрыта по всем параметрам, кроме газов, до конца выращивания. Периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращивания.

Открытые (проточные) культуры характеризуются поступлением свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая питательная среда, но и часть урожая клеточной массы.

Наиболее изучено и распространено закрытое глубинное культивирование. При масштабировании от небольших по объему культур в колбах до больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры культивирования, в частности аэрация и перемешиваемость.

Индукторами синхронизации в системе in vitro могут быть ингибиторы синтеза ДНК или митоза, гормоны, голодание, действие пониженной температуры.

С помощью этих факторов можно получить культуры с митотическим индексом до 30%, тогда как в обычных условиях он составляет 3%.

Как правило, клеточная популяция суспензионных культур не только гетерогенна, но и асинхронна, так как содержит клетки, различающиеся по времени вхождения в митоз. Для синхронизации клеточных культур используют методы индукции, когда течение клеточного цикла блокируется в определенном периоде под влиянием или физических факторов, например, пониженной температурой, или химических соединений.

Так, индукторами синхронизации в системе культивируемых клеток могут быть ингибиторы синтеза ДНК: тимидин, 5-аминоурацил, оксимочевина. В результате обработки клеток этими веществами клеточный цикл продолжается только до Gi-периода и клетки накапливаются перед синтетическим периодом. Удаление из среды ингибитора приводит к синхронизированному переходу клеток к синтезу ДНК, а затем и делению.

Другой способ синхронизации заключается в создании условий «голодания» по одному из компонентов культуральной среды, например, ауксину, цитокинину, углеводам, азоту.

Клетки накапливаются в Giили Ог-периоде клеточного цикла. Затем пассирование суспензии на среду с недостающим компонентом приводит к синхронизации клеточного деления. С помощью индукции синхронизации клеточных делений удается повысить митотический индекс с 2−3 до 30−35%.