Вектора на основе плазмид

Множество клонированных векторов были построены из криптических плазмид лактобактерий. Большинство векторов имеют широкий круг хозяев.

Они в основном относятся к рЕ194 семье, RC плазмидам. Производные этих плазмид могут распространяться в Lactobacillus ssp., Bacillus ssp. и E.coli. Некоторые вектора, полученные из L. fermentum, L. reuteri, L. helveticus, L. acidiphilus, L. crispatus, L. Delbrueckii обладают узким кругом хозяев. Такие вектора интересны из-за безопасности, связанной с использованием жизнеспособных рекомбинантных организмов или генетически модифицированных микроорганизмов в пищевых продуктах или использование в качестве вакцины. Узкий диапазон хозяев считается болеее безопасным, так как они имеют меньше шансов быть горизонтально переданными в другие виды бактерий, чем векторы на основе широкого диапазона хозяев.

Вектора на основе RC плазмид менее стабильны, чем на основе тета плазмид.

Вектора, использованные для трансформации лактобацилл имеют ген устойчивости к эритромицину от рЕ194 или pAM?1 или ген устойчивости к хлорамфениколу из рС194 или pBR322, в качестве селективных маркеров. Устойчивость к ампициллину используется в селекционных векторах для отбора в E.coli. Пищевые селекционные маркеры были разработаны для лактобактерий, используемых в пищевой промышленности.

Пищевые вектора построены на основе криптических плазмид лактобактерий и не содержат гены устойчивости к антибиотикам в качестве маркеров. Также для клонирования векторов можно использовать то, что лактобактерии могут расщеплять различные сахара.

Выбор маркеров имеет первостепенное значение в технологии рекомбинантной ДНК. Исследования должны сосредоточиться на дальнейшем развитии пищевых селективных маркеров, которые подходят для больших объёмов промышленного применения. 10].

Полезные вектора предназначенные для клонирования должны иметь:

• 1. репликон для амплификации вектора в клетках хозяина.
• 2. ауксотрофные или фенотипические маркеры для облегчения идентификации вставок кроме классических генов устойчивости к антибиотикам.
• 3. маркерные гены с уникальными сайтами рестрикции для одной или нескольких различных рестракционных эндонуклеаз. [11]

Используемые векторы для лактобактерий или других грамположительных бактерий можно разделить на два основных класса. Класс 1 представлен стрептококковым pIP501 и энтерококковыми pAM?1 векторами и их производными, представлены большими конъюгативными плазмидами, которые устойчивы к макролидам, линкозамидам и другим антибиотикам. pIP501 и pAM?1 являются тета-плазмидами.

Второй класс векторов полученныый из небольших криптических плазмид из нескольких видов lactococcal. Эти векторы имеют структурную и сегрегационную нестабильность в связи с их механизмом репликации (RCR) и редко поддерживают большие фрагменты ДНК. Они могут использоваться только для клонирования малых генов. Но вектора pSH71 pWV01, относящиеся к данному классу и их производные полезны, так как они имеют широкий диапазон хозяев.

Исследования в настоящее время сосредоточены на создание стабильных клонированных векторов полученных из плазмид с GRAS происхождением. [10].

Наиболее известные клонированные векторы для лактобактерий колеблются от 3 до 10 кб, исключение pVA797, который достигает размера до 30,7 Кб. Источники реплицирующих векторов лактобактерий могут содержать нативную плазмиду из лактобактерий или из других грамположительных бактерий: Bacillus (pBCl), Enterococcus (pAMPl), lactococccus (Psh71, Pwv-01), Staphylococcus (pC194, pCA43), Streptococcus (pIP501, pMV163) и транспозон Tn919 из Streptococcus. Среди них, pC 194, pE194, pSH7 1, PUB 110 и pVA380- 1 RCR типа плазмиды, хотя pAMPl, pIP501, и их производные реплецируется по тета модели.

Генетические маркеры, содержащиеся в векторах лактобактерий, можно разделить на три типа:

• 1) маркёры лекарственной устойчивости.
• 2) маркёры утилизации углеводов.
• 3) маркёры биосинтетических особенностей.

Так как большинство штаммов лактобактерий устойчивы к ампициллину, клоксациллин, гентамицин, канамицин, неомицин, пенициллин, стрептомицин, тетрациклин и др, то эти маркеры редко используются для построения векторов лактобактерий.

Маркеры лекарственной устойчивости не могут функционировать в большинстве лактобактерий например pSA3 с сопротивлением к эритромицину может обеспечить устойчивость к эритромицину трансформантов L. Casei 393, но не L. Casei MSK248.

Некоторые вектора лактобактерий имеют специфические функции, помимо общей функции клонирования. Вектора лактобактерий можно классифицировать:

• 1) интегрированные векторы.
• 2) векторы экспрессии.
• 3) многовекторные сайты клонирования.
• 4) репликонклонированные векторы.
• 5) позитивные векторы селекции.
• 6) промоутерные клонированные векторы.
• 7)векторыпромоторы секреции сигнальной последовательности.
• 8) чувствительные к температуре векторы и т. д.

Вектора были построены путем выделения фрагментов ДНК из хромосомы, плазмиды или фага лактобактерий и лигированием фрагмента в вектор. Фрагмент ДНК, содержащий весь вектор обычно интегрируется в хромосому хозяина, плазмиду или геном фага гомологичной рекомбинации.

Таблица 4- Круг хозяев репликонов лактобактерий и других бактерий, методы трансформации.

На основе различных источников и структур интеграционные последовательности могут быть классифицированы на семь групп:

• 1) случайно клонированные фрагменты хромосом,
• 2) случайно клонированные фрагменты плазмид,

Примерами этих двух групп являются pCITI104, pCIT 1105, pGIP2 12X, pH42 1, pJRl и pEI1400. Они были интегрированы в хромосому или плазмиду на неизвестные сайты благодаря неспецифической интеграции фрагментов ДНК.

• 3)инсерционные последовательности, например pTRK327 содержит вставки последовательностей (IS3) из хромосомы L. jahnsonii и может интегрироваться случайно в хромосому хозяина.
• 4) клонированные гены из хромосомы, к этой группе относятся pGAF00l, pGIw3, pSUWlO4, pSUW200, pSUW20 1, pSUW202, pTHC1. Они состоят из cbh (коньюгативные гидролазы желчные соли гидролазы) или pepXP (X-пролил-дипептидил аминопептидаза) генов из лактобактерий. Вставляется в хромосому на специфических сайтах.
• 5) ДНК фрагменты фага. К этой группе относится вектор pTRK170.
• 6) ДНК фрагмент фага, содержащий сайты связывания (attP) и интегразные гены (intG) и другие.

Примерами группы 6 являются pMC1, pTRKlS2, pTRK209, pTRK318.

Таблица 5- Вектора лактобактерий, обладающие специальными функциями.

Векторы экспрессии содержат не только чужеродный ген, но и промотер, оператор, и терминаторную последовательность, что требуется для эффективно транскрипции. Векторы экспрессии также содержат сайт связывания рибосом, который необходим для эффективной трансляции. Вектор, содержащий функциональный промотор, который может экспресировать клонированные гены должен быть соединен с промотером.

Методы введения векторов в лактобактериях делятся на шесть категорий: коньюгация, электропорации, мобилизация, слияние протопластов, трансформации протопластов, и трансдукции. Эти методы были применены в 17 видах лактобактерий, но не для одного из видов лактобацилл нет разработок, чтобы использовать все эти методы переноса ДНК.

При переносе вектора в клетку хозяина, существующие плазмиды содержат те же или аналогичные репликоны и поэтому они могут быть несовместимы. Нативные плазмиды и трансформированные вектора могут конкурировать за компоненты, необходимые для репликации. Многие случаи несовместимости плазмид в лактобактериях не известны. Нативная плазмиды pWS97 L. delbruckii SSP. Lactis WS97 была удалена, когда штамм был введен с вектором pJK300, содержащем репликон из плазмиды.

Вектор может устойчиво поддерживаться в культуре клеток путем интегрирования в гомологические сайты в хромосоме хозяина (меньшее количество копий), чем она существует в цитоплазме внехромосомно (более высокое количество копий).

Примеры интегрированных векторов применяемых в лактобактериях приведены в таблице 6.

Таблица 6 — Интегрированные вектора лактобактерий.