Окраска спор. 
Визуализация внутриклеточных структур микроорганизмов с помощью световой микроскопии

Неокрашенные споры живых бактерий имеют при наблюдении в обычный микроскоп черное обрамление и ярко светятся в плоскости, находящейся немного выше положения истинного фокуса. Не следует считать, однако, что любая сильно преломляющая свет структура внутри бактерии — это эндоспора, особенно если отсутствует информация о теплоустойчивости.

Прямой тест на присутствие эндоспор возможен благодаря явлению, которое наблюдается во многих эндоспорах после погружения в окислитель в кислой среде (например, 0,1% КМn0₄ в 0,3н HNOз или 0,3н НСl). При этом оболочка споры теряет целостность, а часть ее протоплазмы, теперь легко окрашиваемая основными красителями, выпячивается наружу через образовавшуюся брешь. Этот тест удобно проводить, помещая высушенную на покровном стекле пленку спор на 10—20 минут в раствор окислителя; «лопнувшие» споры видны без окраски, хотя последняя делает их более легко различимыми.

Имеется несколько удовлетворительных методов для окрашивания эндоспор в бактериях. При использовании простейшего из них — негативного окрашивания — получают нефиксированные препараты, материал которых имеет негативный вид. Для осуществления метода взятый петлей 7%-й водный нигрозин смешивают на покровном стекле с набранной петлей культурой, смесь распределяют в виде тонкой пленки и высушивают на воздухе. Покровное стекло переворачивают пленкой вниз, помещают на предметное стекло и закрепляют в нескольких местах свечным воском. Эндоспоры выглядят, как сильно преломляющие свет сферические или эллипсоидальные образования, находящиеся как внутри, так и за пределами клеток бактерий.

Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру.

• 1. Образец, фиксированный нагреванием на предметном стекле, высушивают на воздухе и покрывают квадратным кусочком фильтровальной бумаги или салфетки, подогнанным по размеру стекла.
• 2. Насыщают бумагу раствором карболового фуксина и выпаривают его 5—10 минут, как описано выше, поддерживая влажное состояние добавлением красителя по мере испарения. Выпаривать можно и по-другому, помещая стекла на штатив, находящийся над емкостью с кипящей водой.
• 3. Удаляют промокательную бумагу и обесцвечивают мазок смесью кислоты и спирта в течение 1 минуты. Промывают водопроводной водой и подсушивают промокательной бумагой.
• 4. Высушивают тонкий, нанесенный на предметное стекло слой водного насыщенного раствора нигрозина и просматривают стекло в микроскоп (раствор нигрозина готовят следующим образом: смесь 10 г нигрозина и 100 мл дистиллированной воды погружают на 30 минут в кипящую воду, охлаждают и для лучшего хранения добавляют 0,5 мл формалина; перед использованием смесь фильтруют).

Вегетативные клетки бесцветны, эндоспоры окрашены в красный цвет, а фон — в черный.

В модифицированном методе Дорнера смешивают в пробирке водную суспензию бактерий с равным объемом карболового фуксина. Пробирки опускают на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем набранный петлей 7%-й водный нигрозин смешивают на покровном стекле с небольшим количеством (одна петля) подвергшейся нагреванию суспензии бактерий; после подсушивания на воздухе образуется тонкий мазок. Результаты получают те же, что указаны выше, но методика менее трудоемкая.

Метод окраски эндоспор по Шефферу-Фултону В этом методе вместо карболового фуксина применяется 0,5%-ный водный малахитовый зеленый. Образец высушивают на воздухе на предметном стекле, фиксируют нагреванием, покрывают промокательной бумагой или бумажной салфеткой, пропитанной до насыщения красителем, и помещают на 5 минут над кипящей водой. Стекло промывают водопроводной водой, и мазок дополнительно окрашивают 30 секунд сафранином, как при окраске по Граму. Затем вновь промывают и подсушивают мазок промокательной бумагой. Эндоспоры окрашиваются в ярко-зеленый цвет, а вегетативные клетки — в красно-коричневый [5].

Метод Виртца в модификации Саватеева.

К насыщенному водному раствору (около 5%) малахитовой зелени добавляют 5% глицерина, пропитывают смесью полоски фильтровальной бумаги и высушивают их (лучше при 50°С). Затем готовят 0,5%-й водный раствор сафранина, которым смачивают другие полоски фильтровальной бумаги, и высушивают. Сохраняют окрашенные бумажки в закрытых банках в защищенном от солнечного света месте.

Техника окраски. На фиксированный над пламенем мазок наносят 2—3 капли дистиллированной воды и накладывают полоску бумаги, окрашенной малахитовой зеленью. Препарат нагревают над пламенем до появления паров (3—4 раза), приблизительно в течение минуты. При испарении добавляется вода. После остывания препарата смывают краску с бумажкой струей водопроводной воды (30 секунд), и тотчас же на мокрую поверхность препарата кладут бумажку, окрашенную сафранином. Если необходимо, добавляют несколько капель воды. Через 30—40 секунд мазок промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина: свободно лежащие споры — зеленовато-голубого цвета, споры внутри микробных клеток — темно-зеленые, вегетативные формы микробов — красные.

Модификация Шеффер и Фултона.

• 1. На фиксированный в пламени мазок наливают насыщенный (5%) водный раствор малахитовой зелени на 3 0—60 секунд с подогреванием до появления паров (3—4 раза).
• 2. Краску смывают текущей водой 30—40 секунд.
• 3. Наливают 0,5% водный раствор сафранина приблизительно на 30 секунд.
• 4. Промывают водой, высушивают через фильтровальную бумагу.

Микроскопическая картина: споры — зеленые, вегетативные формы — красные [1].

Метод Циля-Нильсена в модификации Мюллера До фиксации мазка на пламени препарат готовят обычным способом. Далее на фиксированный в пламени и остывший препарат наносят 5%-й раствор хромовой кислоты. Через 5—10 мин кислоту смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги, обильно смачивают бумагу карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров (не до кипения), отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя. Так в течение 7 мин. При этом важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения ее снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой.

В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются. Далее обесцвечивают цитоплазму клеток, обрабатывая препарат 1%-м раствором соляной или серной кислоты 15—30 секунд. При приготовлении препарата спор Bacillus mycoides или В. mesentericus рекомендуется обесцвечивать цитоплазму 16—18 с. При превышении этого времени может обесцветиться и спора.

Затем препарат промывают водой и окрашивают метиленовым синим 2 мин. Если все операции проделаны правильно, окраска получается контрастной, и споры ярко-красного цвета будут четко выделяться на голубом фоне цитоплазмы.

Метод Пешкова На фиксированный в пламени препарат наливают метиленовый синий Леффлера, доводят его до кипения и кипятят 15—20 секунд, держа над пламенем. Мазок промывают водой и докрашивают в течение 30 с 0,5%-м водным раствором нейтрального красного. Снова промывают, подсушивают и исследуют препарат с масляной иммерсией объектива. Споры получаются голубые или синие, цитоплазма — розовая.

Для исследования спор хорошими объектами могут служить культуры Bacillus mesentericus и В. mycoides в возрасте четырех суток.

Реактивы для окрашивания спор бактерий:

• 1. Карболовый фуксин Циля
• 2. Метиленовый синий Леффлера
• 3. Метиленовый синий, насыщенный водный раствор: 2 г красителя и 100 мл дистиллированной воды.
• 4. Хромовая кислота, 5%-й раствор.
• 5. Соляная (или серная) кислота, 1%-й раствор [4].

Способ Ауески На приготовленный, высушенный на воздухе (нефиксированный) мазок наливают 1—2% водный раствор соляной кислоты и подогревают на пламени до появления паров (3—4 раза). Затем препарат промывают водой, высушивают через фильтровальную бумагу, фиксируют на пламени и окрашивают карболовым раствором фуксина при нагревании (до появления паров) в течение 3—5 минут. Потом препарат обесцвечивают 5% водным раствором серной кислоты в течение нескольких секунд (до бледно-розовой окраски), промывают водой и дополнительно окрашивают леффлеровской метиленовой синькой или 1% водным раствором малахитовой зелени в течение 2 минут. Краску смывают водой, мазок высушивают.

Микроскопическая картина; споры — красные, вегетативные формы — синие (или зеленые).

Способ Клейна.

• 1. готовят в пробирке густую эмульсию путем смыва исследуемой культуры физиологическим раствором,
• 2. к эмульсии прибавляют равное количество карболового раствора фуксина,
• 3. пробирку со смесью нагревают на пламени до появления паров в течение 5 минут;
• 4. из прогретой смеси приготовляют мазок, высушивают его и фиксируют;
• 5. обесцвечивают 1% водным раствором серной кислоты в течение 5−10 секунд;
• 6. промывают водой; подсушивают;
• 7. окрашивают Леффлеровской синькой на протяжении 1−3 минут;
• 8. смывают водой и мазок обсушивают.

Микроскопическая картина: споры — красные, вегетативные формы — синие. Недостаток способа — значительный расход краски (фуксина) [1].