Производство амилазы
Особенности применения продукта в производстве продуктов питания амилаза биотехнологический Амилазы находят применение почти во всех областях, где перерабатывается крахмалсодержащее сырьё. Амилазы используются для осахаривания зернового и картофельного крахмала. Самым большим потребителем амилолитических ферментов является спиртовая и пивоваренная промышленности, где в настоящее время солод… Читать ещё >
Производство амилазы (реферат, курсовая, диплом, контрольная)
Введение
Амилазы использовались человеком давно, однако их изучение началось с открытия Кирхгофом в 1814 г. вещества, способного превращать крахмал в сахар. Препарат, полученный Кирхгофом из пшеничной муки, обладал способностью разжижать крахмальный клейстер и превращать его в сахарный сироп. Аналогичное явление автор наблюдал при смешивание крахмального клейстера с ячменным солодом. Уже в этих первых исследованиях Кирхгоф отметил губительное действие на это вещество серной кислоты. В то же время он подчеркнул, что сахарообразование является необходимы условием для сбраживания крахмалсодержащих материалов и таким образом положил начало научному объяснению технологии брожения.
Биологически активное вещество в дальнейшем было выделено из солода и подверглось детальному изучению. Было обнаружено, что его действие на крахмал проходит через три стадии: разжижение, декстринизацию и осахаривание. Это привело к признанию существования в солоде двух различных компонентов, которые в дальнейшем были по лучены в отдельности и названы а-амилазой (декстринирующий компонент) и в-амилазой (осахаривающий компонент).
б-Амилазы и в-амилазы широко распространены в высших растениях. Наиболее важным источником амилаз являются хлебные злаки, зерно которых в проросшем состоянии (в виде солода) находит широкое применение в промышленном гидролизе крахмала. Солод из ячменя, ржи, пшеницы, овса, проса в настоящее время используется для осахаривания крахмала в спиртовом производстве.
1. Общая характеристика амилаз Классификация ферментов.
Класс. | Катализируемая реакция. | Тип реакции. | Важнейшие подклассы. | |
КФ 1. Оксидоредуктазы. | Окислительно-восстановительные реакции. Перенос атомов H и O или электроновот одного субстрата на другой. | AH + B > A + BH (восстановленный). A + O > AO (окисленный). | дегидрогеназа, оксидаза, пероксидаза, редуктаза, монооксидаза, диоксигеназа. | |
КФ 2. Трансферазы. | Перенос функциональной группы от одного субстрата на другой. Это может быть метильная, ацильная, фосфатная группа или аминогруппа. | AB + C > A + BC. | аминотрансфераза, фосфотрансфераза, C1-трансфераза, гликозилтрансфераза. | |
КФ 3. Гидролазы. | Образование двух продуктов из одного субстрата в результате гидролиза. | AB + H2O > AOH + BH. | эстераза, гликозил-гидролаза, пептидаза, амидаза. | |
КФ 4. Лиазы (синтазы). | Негидролитическое добавление или удаление группы к или от субстрата. Образование C-C, C-N, C-O или C-S связи. | RCOCOOH > RCOH + CO2. | C-O-лиаза, C-S-лиаза, C-N-лиаза, C-C-лиаза. | |
КФ 5. Изомеразы. | Внутримолекулярная перестановка, то есть изомеризация молекулы субстрата. | AB > BA. | эпимераза, цис-транс-изомераза, внутримолекулярная оксидоредуктаза и др. | |
КФ 6. Лигазы (синтетазы). | Соединение двух молекул в результате синтеза новой C-O, C-S, C-N или C-Cсвязи, сопряжённое с одновременным гидролизом АТФ. | X + Y+ ATP > XY + ADP + Pi. | C-O-лигаза, C-S-лигаза, C-N-лигаза, C-C-лигаза. | |
Согласно современной классификации и номенклатуре ферментов аамилаза получила название б-1,4-глюкан-4глюкангидролаза; вамилаза — б -1,4-глюкавмальтогидролаза; глюкоамилаза-б -1,4-глюкогидролаза;олиго- 1,6-глюкозидаза декстрин-6-глюкангидролаза.
Роль б-амилаз при гидролизе крахмала исключительно велика. Из трех основных функций при действии на клейстеризованный крахмал (разжижение, декстринизация, осахаривание) разжижение и декстринизация зависят от б-амилаз. Они атакуют не только клейстеризованный, но и нативный крахмал, разрушая крахмальные зерна.
б-Амилазы различного происхождения имеют много общих свойств: хорошо растворяются в воде или в сильно разбавленных растворах солей.
Более концентрированные растворы солей (например, 20 — 30%ные растворы сульфата аммония) вызывают осаждение этих ферментов, б-Амилазы легко растворяются в разбавленных растворах этилового спирта, но осаждаются при его концентрации в среде свыше 60%. Белок б-амилаз обладает слабокислыми свойствами; изоэлектрическая точка ферментов колеблется в пределах pH 4,2—5,7. Молекулярная масса солодовой б-амилазы 60 000, б-амилаз микроскопических грибов — 45 000—50 000. Многие из известных ныне б-амилаз получены либо в высокоочищенном, либо в кристаллическом виде.
Действуя на целое крахмальное зерно б-амилаза атакует его, разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, т. е как бы раскладывает зерно на части. Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образование не окрашиваемых йодом продуктов в основном низкомолекулярных декстринов. Процесс гидролиза крахмала многостадийный.
а — ферментативный гидролиз амилозы; б — начальная стадия гидролиза амилопектина; в — конечная стадия осахаривания амилопектина.
Рисунок 1.1 Стадия гидролиза крахмала б-амилазой:
В результате воздействия аамилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашивающиеся йодом тетраи тримальтоза, которые очень медленно гидролизуются бамилазой до дии моносахаридов. Все б-амилазы проявляют наименьшее сродство к гидролизу концевых связей в субстрате. Некоторые же or-амилазы, особенно грибного происхождения, на второй стадии процесса гидролизуют субстрат более глубоко с образованием небольшого количества мальтозы и глюкозы.
Ионы кальция оказывают стабилизирующее действие на аамилазы. Это впервые было обнаружено Воллерштейном, затем подтверждено Накамурой. В настоящее время это явление отмечено почти для всех амилаз. Однако теоретически этот вопрос применительно к промышленному гидролизу крахмала до сих пор не разработан.
б-Амилаза солода и глюкоамилаза микроскопических грибов являются осахаривающими ферментами, образующими при гидролизе крахмалаебраживаемые сахарамальтозу и глюкозу соответственно.
в-Амилазатипичный представитель амилаз высших растений. Ее действие на крахмал, содержащий бгликозильные связи, ведет к образованию вмальтозы. Это явление было первым признанным примером а-гидролиз амилозы; б-гидролиз наружных ветвей амилопектина (в-декстрин обведен пунктирной линией) Рисунок 1.2 Действие в-амилазы на крахмал Открытие глюкоамилаз, называемых иначе г-амилазами, амилоглюкозидазами, б-глюкозидазами или така-амилазами В, связано с исследованием ферментов микроскопических грибов, используемых в производстве спирта.
Согласно новой номенклатуре глюкоамилаза должна расщеплять лишь б — 1,4-связи в полии олигосахаридах. Однако установлено, что этот фермент расщепляет также б-1,6-глюкозидные связи. Поэтому для глюкоамилазы предложено систематическое название б-1,4-:1,6-глюкан-4:6- глюкангидролаза. Таким образом, под рабочим названием глюкоамилазы следует иметь в виду фермент, расщепляющий в крахмале и олигосахаридах б-1,4- и б-1,6-глюкозидные связи. Существование в микроскопических грибах таких ферментов, как олиго- 1,6-глюкозидаза (конечная декстриназа) и изомальтаза, расщепляющих б-1,6- связи, некоторые исследователи ставят под сомнение. Весьма активная глюкоамилаза содержится в микроскопических грибах.
2. Обзор возможных способов получения Амилолитические препараты могут быть получены из поверхностных и глубинных культур. Получение препаратов амилаз из поверхностных культур. Средой для выращивания продуцентов являются пшеничные отруби с добавлением до 25% солодовых ростков, увлажненные водой, подкисленной 0,1 н. раствором серной или соляной кислоты. Выход готовой культуры составляет обычно от 70 до 80% массы среды. Продуцентами аамилазы и глюкоамилазы чаще всего используются микроскопические грибы A. oryzae, A. awamori, A. niger, R. delemar и др. В Японии при твердофазном культивировании применяют бактерии В. subtilis и В. amylosolvents. Режимы выращивания зависят от физиологии продуцента.
Экстракт из поверхностной культуры может быть использован для получения очищенных амилолитических препаратов путем осаждения ферментов органическими растворителями или нейтральными солями. Амилазы выпадают в осадок почти полностью (93−96%) при концентрации этанола в растворе 69−72%, ацетона 60−62 и изопропанола 54−55%. Но сейчас поверхностная культура не считается перспективным сырьем для производства высокоочищенных амилолитических препаратов.
Получение препаратов амилаз из глубинных культур. В настоящее время в нашей стране для получения амилолитических ферментных препаратов преимущественно используется глубинный способ культивирования продуцентов. В качестве продуцентов используют грибы рода Aspergillus (A. oryzae, A. usamii, A. batatae), спороносные бактерии, относящиеся к группам В. subtilis — mesentericus, дрожжеподобные организмы родов Endomycopsis, Endomyces и многие другие микроорганизмы.
Источники азота. Выбор сред для каждого продуцента про водится опытным путем с учетом физиологических потребностей продуцента и условий производства. Например, при изучении факторов, влияющих на биосинтез ферментов, было показано, что культура В. subtilis 103 весьма чувствительна к источнику азота в среде (табл. 1.1.).
Таблица 1.1.
Источник азота. | Активность б-амилазы, ед. | рН исходной среды. | рН Культуральной жидкости. | биомассы, г на 100 мл. | |
Цитрат аммония двузамещаемый. | 82,8. | 6,9. | 7,5. | 0,84. | |
KN. | 14,4. | 6,9. | 6,1. | 0,11. | |
NN. | 6,9. | 4,45. | 0,26. | ||
(NS. | 6,9. | 4,8. | 0,40. | ||
(NHP. | 86,4. | 6,9. | 5,6. | 0,80. | |
NCl. | 43,2. | 6,9. | 7,4. | 0,40. | |
Казеин. | 24,0. | 6,9. | 7,7. | 0,80. | |
Пептон. | 43,2. | 6,9. | 7,5. | 1,00. | |
Кукурузный экстракт. | 36,0. | 6,8. | 7,6. | 1,00. | |
Глютеин. | 14,4. | 7,0. | 6,8. | 0,74. | |
Наилучшие результаты согласно данным К. А. Калунянца и др. (1979) наблюдаются в присутствии двузамещенного цитрата аммония — 82,8 ед. АС/мл и (NH4)2HP04 — 86,4 ед. АС/мл. Органические источники азота менее эффективны, чем неорганические.
Дополнительное введение азота в виде экстрактов из растительного, животного и микробного материала к (NH4)2HP04 позволяет на 30−40% повысить продуцирующую способность бактерий и достичь активности 110−114 ед. АС/мл (табл 1.2.).
Таблица 1.2.
Вариант среды. | (NHP. | Азотсодержащая добавка. | Количество довавки. | рН Исходной среды. | рН готовая культуральная жидкость. | Актив. б-амилаз ед. | |
1,0. | Пептон. | 0,9. | 6,9. | 7,2. | 108,4. | ||
1,0. | Кукурузный Экстракт. | 0,9. | 6,8. | 7,3. | 111,6. | ||
1,0. | Экстракт солодовых ростков. | 5,0. | 6,8. | 6,6. | 114,0. | ||
1,2. | Кукурузный экстракт и пивные осадочные дрожжи. | 0,8. и 0,4. | 6,7. | 7,2. | 111,6. | ||
Источники углерода. Главным источником углерода в среде для всех продуцентов б-амилазы является крахмал различного происхождения. Используют чаще всего крахмал картофельный или кукурузный, который вводится в среду в клейстеризованном состоянии. Вместо крахмала может применяться крахмалсодержащее сырье, например ячменная или кукурузная мука. Все эти компоненты используются в нативном виде или в виде различных гидролизатов.
Установлено, что биосинтез б-амилазы протекает более интенсивно, если крахмал частично гидролизовать в процессе приготовления питательной среды, не допуская при этом накопления в среде низкомолекулярных дисахаров (мальтозы) и особенно глюкозы (табл 1.3.).
Таблица 1.3.
Вариант среды. | Способ обработки крахмала в питательной среде. | рН готовой культуральной жидкости. | Активность б-амилазы в КЖ ед. | Активность б-амилазы в КЖ. % от контроля. | |
Гидролизат крахмала при длительности гидролиза ф=10 мин. | 5,70. | 177,0. | 158,5. | ||
Гидролизат крахмала при ф=60 мин. | 5,65. | 168,0. | 150,5. | ||
Гидролизат крахмала при ф=1,5 ч. | 5,72. | 180,0. | 161,0. | ||
Гидролизат крахмала при ф=18 ч. | 5,68. | 180,0. | 161,0. | ||
Поэтому, если состав среды предусматривает высокое содержание крахмала, целесообразно вводить его порциями по мере потребления культурой микроорганизма, что позволяет избежать явления катаболитной репрессии синтеза, а — или глюкоамилазы (рис. 1.3).
1-контроль; 2-дробный режим введения крахмала в количестве 0,5%.
Рисунок 1.3 Влияние дробного введения крахмала.
3. Обоснование целесообразности использования биотехнологический приемов в производстве амилаз Амилазы для промышленного применения получают только биотехнологическими приемами — биосинтезом с помощью микроорганизмов, так как в растениях их содержится в небольших количествах и выделять их экономически не целесообразно.
При биотехнологических приемах используются мягкие режимы выращивания биомассы продуцента и выделение ферментов (амилаз), так как основная масса продуцентов относится к мезофильным микроорганизмам, оптимум роста для которых находится при температуре 28−36°С.
Использование ферментов — биологических катализаторов — очень заманчивая вещь. Ведь они по многим своим свойствам, прежде всего активности и избирательности действия (специфичности), намного превосходят катализаторы химические. Ферменты обеспечивают осуществление химических реакций без высоких температур и давлений, а ускоряют их в миллионы и миллиарды раз. При этом каждый фермент катализирует только одну определённую реакцию.
Биологические катализаторы можно использовать также не извлекая их из живых организмов, прямо в бактериальных клетках, например. Этот способ, собственно, есть основа всякого микробиологического производства, и применяется он издавна.
Разработка способа повышения устойчивости ферментов значительно расширяет возможности их использования. С помощью ферментов можно, например, получать сахар из растительных отходов, и этот процесс будет экономически рентабельным. Уже создана опытная установка для непрерывного производства сахара из клетчатки.
4. Описание технологических стадий и режимов производства амилолитического ферментного препарата В Последовательность стадий получения ферментного препарата, содержащего б-амилазу, представлена на рисунке 1.4.
В настоящее время для получения амилолитических ферментных препаратов преимущественно используется глубинный способ культивирования.
Продуцентами при данном способе культивирования являются: микроскопические грибы рода Aspergillus (A. Oryzae, A. Ussamii, А. Batatae), спороносные бактерии, относящиеся к группам Bacillus. Subtilis-mesentericus, дрожжеподобные организмы родов Endomucopsis, Endomyces и многие другие микроорганизмы.
Рисунок 1.4. Схема получения ферментного препарата Приготовление посевного материала. Этапы получения посевной культуры следующие: 1) обновление исходной культуры на агаризованной среде; 2) выращивание культуры продуцента на жидкой среде в колбах на качалке; 3) культивирование продуцента в малом, а затем, если требуется, в большом инокуляторе. Посевная доза при засеве производственной среды составляет 4% по объему.
Компонентами среды являются: кукурузная мука, крахмал, патока, гидролизатыказеина и дрожжей, древесины, липиды, минеральные соли. (Содержание СВ от 1,5 до 15,5%, pH от 3,5- 8,5).
Приготовление питательной среды включает в себя составление композиции для роста биомассы и накопления ферментов. В питательную среду входит следующий состав (в %): (NH4)2HPO4 — 0.8; КН2РО4 -0.1; KNO3 -0.11; кукурузный экстракт — 1. Среду стерилизуют для удаления посторонней микрофлоры при температуре 121 °C в течение 1 часа. Температура культивирования: 26−32 С для грибов, а для бактерий 32−35 С. Режим аэрации: 50- 60 м3/ч м3.
Ферментация — процесс, осуществляемый с помощью культивирования микроорганизмов. Ферментация — это комплекс процессов, в который входят рост и развитие клеток, биосинтез ферментов, тепловыделение, транспорт метаболитов в культуральную жидкость. Исходный pH питательной среды 6,5−7,0 поддерживают на оптимальном уровне с помощью мела. Процесс протекает при температуре 35 °C и длительность ферментации составляет 55 -60 ч. На рост и развитие клеток существенное влияние оказывает концентрация питательных веществ в субстрате.
Фильтрация — процесс разделения суспензии с использованием пористых перегородок, которые задерживают твердую фазу суспензии и пропускает ее жидкую фазу. Полученную биомассу продуцента вместе с нерастворимыми частицами среды при необходимости стерилизуют, высушивают и используют на корм животным. Фильтрат культуральной жидкости нестабилен, он не может хранится и должен немедленно направляться на дальнейшую обработку для получения очищенных ферментных препаратов.
Выпаривание — процесс концентрирования растворов путем частичного испарения жидкого растворителя. Фильтраты глубинной культуры являются нестабильными при хранении. Для получения готовых форм их необходимо сконцентрировать. Ферменты очень чувствительны к термической обработке и нуждаются в мягких режимах концентрирования. При температуре греющего пара 90−100″ С и при температуре кипения 35- 40 С потери активации не превышают 10%.
Сепарирование — разделение под действием центробежных сил. Во вращающемся потоке на взвешенную частицу действует центробежная сила, направляющая ее от центра к периферии.
=.
где Gk — центробежная сила, m-масса частицы, r-радиус вращения, wrокружная скорость.
Сепарирование применяется, когда концентрация взвешенных частиц в жидкости, их размер не очень велики Образовавшийся осадок балластных веществ удаляется из культуральной жидкости, а очищенная жидкость подвергается осаждению.
Осаждение — выделение целевого продукта путем добавления к жидкости реагента, взаимодействующего с растворенным продуктом и переводящего его в твердую фазу. Широкое распространение, для выделения ферментов из водных растворов, получил метод осаждения этанолом, изопропанолом и ацетоном. Добавление таких реагентов вызывают потерю растворимости белковых молекул, и сопровождается образованием осадка из-за снижения полярности среды в присутствии осадителя. В водной среде энергия притяжения молекул фермента и диполей воды (энергия сольватации) превосходит взаимопритяжение молекул фермента, в связи, с чем образуется устойчивый раствор. При определенной концентрации органического растворителя энергия сольватации становится меньше энергии связи между диполями воды и молекулами растворителя, так как он обладает более сильной полярностью. В результате сольватная оболочка белковой молекулы разрушается, что приводит к коагуляции белка. При осаждении 2−2,5 объемами изопропанола активность ферментов в осадках сохраняется на 93−95% от исходной, pH обрабатываемого раствора 6,5−6,8.
Стандартизация ферментных препаратов. Для получения постоянной активности в препараты вводится наполнитель в определенном количестве, которое зависит от полученной активности в культуре и препарате. Желательно, чтобы наполнитель по отношению к ферменту выступал и в роли стабилизатора, а не просто инертного соединения. Известно, что хорошим стабилизатором амилолитических ферментов хлористый натрий. С внесением наполнителя в виде 1% хлористого натрия показали возможность получения из фильтрата культуральной жидкости и грибной культуры сухих амилолитических ферментных препаратов с индексом ГЗх. Количество наполнителя можно рассчитать по формуле:
S=-b.
где S — количество наполнителя, необходимое для получения стандартного по активности препарата, кг; а — активность исходного препарата, ед. ФА/г; b — количество исходного препарата, кг; с — стандартная активность препарата, ед. ФА/г/.
Сушка — удаление влаги из твердых и пастообразных материалов путем ее испарения и отводом образовавшихся паров. Движущей силой этого процесса является разница давлений насыщенных паров над влажным материалом и в газе.
Р = р* -р Для обезвоживания ферментных растворов применяют сушку в вакуум-сушильных шкафах, распылительных и сублимационных установках. При высушивании ферментсодержащих материалов имеется ряд трудностей, связанных с большой термолабильностью ферментов.
Сушку проводят распылением при мягком режиме (температура теплоносителя на входе 120 — 125 °C и на выходе 55 — 60 °С). Длительность распылительной сушки очень мала, пребывание препарата в сушильной башне ограничивается 5−8с. При соприкосновении массы с теплоносителем влага мгновенно испаряется, частицы охлаждаются и поэтому, несмотря на довольно высокие температуры теплоносителя на входе и выходе, препарат не нагревается более 35−40 °С. Потери активности сравнительно малы (7−10%).
5. Химический состав и физико-химические свойства сырья и полуфабрикатов Кукурузная мука. Является самым дешевым продуктом из всех зерновых и ее цена зависит от степени измельчения (помола).
Таблица 1.5. Химический состав сырья.
%. | ||
Крахмал. | 67−70. | |
Другие углеводы. | ||
Белки. | ||
Глютетелин. | ||
Зеин. | ||
Количество зольных веществ. | 0,92. | |
Ангидрид фосфорной кислоты. | ||
Окись калия. | ||
Окись магния. | ||
Влажность не должна превышать. | ||
Гидролизаты древесины. Сама древесина является не очень «вкусным» сырьем для микроорганизмов, но после предварительной обработки — высокотемпературного кислотного гидролиза — превращается в гидролизаты. Целлюлоза и пентозаны гидролизуются до глюкозы и других сахаров. Содержание сахаров зависит от породы древесины и технологии гидролиза и составляет 4−8%. Кроме древесины можно использовать для тех же целей различные целлюлозосодержащие сельскохозяйственные отходы (солому, кукурузные кочерыжки, стебли хлопчатника и т. п.).
Дрожжевые гидролизаты в высушенном виде содержат до 52% органического азота, в основном в виде аминокислот.
Кукурузный экстракт — отход крахмалопаточного производства, получающийся путем упаривания жидкости от замачивания («настоя») кукурузных зерен (замочная жидкость) с содержанием сухих веществ не ниже 48%. В процессе замачивания происходит ферментный гидролиз белков кукурузы, вследствие чего около половины азотсодержащих веществ экстракта представляет собой смесь аминокислот, полипептидов и белков. Экстракт — темная вязкая жидкость, содержит 6,4−8% общего азота, не более 24% золы. В золу входят фосфор, калий, магний, причем фосфор — до 5%, частично в связанном состоянии в виде фитина. Имеются также витамины группы В (биотин), ростовые вещества и биостимуляторы. Таким образом, кукурузный экстракт представляет собой хорошую смесь источника питания.
Продуценты. Плесневые грибы рода Aspergillius, видов niger, orizae, usamii, awamori, batatae; рода Rhizopus, видов delemar, tonkinensis, niveus, japonicum и др., а также отдельные представители Neurospora crassa и Mucor.
Плесневые грибы очень широко распространены в природе; основное место их обитания — почва. Несмотря на наличие многих родов и видов плесневых грибов все они характеризуются нитевидным строением тела и специфическим строением плодоносящих органов. Тело гриба состоит из длинных переплетенных нитей сероватого или белого цвета, называемых гифами. Гифы распространяются по поверхности питательного субстрата, образуя мицелий и частично врастают в него. Некоторые гифы, поднимающиеся над поверхностью в виде легкого пушка, имеют более сложное строение и представляют собой органы плодоношения, называемые конидие или спорангиеносцами. У мукоровых грибов на конце спорангиеносца находится шаровидное вздутие, окруженное оболочкой, внутри которого образуются споры. У аспергиллов конец конидиеносца имеет булавовидное утолщение, от которого отходят удлиненные клетки, называемые стеригмами; от стеригм отшнуровываются более мелкие круглые клетки — конидии.
Отделившиеся конидии или споры, попадая в благоприятные условия, начинают прорастать, затем гифы ветвятся, образуя мицелий; при истощении питательных веществ в среде гриб переходит — в стадию спороили конидиебразования. Споры и конидии плесневых грибов содержат пигменты, что и придает зрелым культурам характерную окраску.
Аспергиллы являются типичными аэрофилами, поэтому они могут развиваться только на поверхности твердой или жидкой среды или в жидкой, достаточно аэрируемой среде. Оптимальная температура для, большинства аспергиллов 25—30°С, для некоторых — до 35 °C. Большинство грибов при поверхностном культивировании могут переносить кратковременное повышение температуры до 40 и даже 45 °C без заметной потери активности ферментов. Оптимальная влажность среды для них около 65%.
Для питания аспергиллов необходимы азотистые и минеральные вещества. В качестве источника углевода кроме моносахаридов, многих олигои полисахаридов могут служить спирты и органические кислоты, однако для накопления амилазы в среде обязательно должны присутствовать крахмал, декстрины или мальтоза. На средах, содержащих другие сахара, в том числе глюкозу грибы амилазы не образуют. Источником азота могут быть белки и их гидролизаты, аммонийные соли и нитраты.
6. Расчет теоретического выхода целевого продукта.
1. Составляем предварительную рецептуру синтетической питательной среды для выращивания биомассы:
компонент «С» — амилаза, компонент «N» — кукурузный экстракт, (NH4), НР04.
Компонент «О» — воздух.
2. Составляем стехиометрическое уравнение:
уА А + vВ+ v С>+F+G (4.1).
3. Для расчета стехиометрических коэффициентов составим формулу биомассы бактерий.
Элементарный состав биомассы: С -53%, Н-7%, N-12%, О- 20%, S-1% и золы -4%. В первом приближении формула биомассы бактерий имеет вид:
В гипотетической молекуле биомассы не может быть дробных атомов, поэтому умножим коэффициенты на 100: Н 700 0125 N 8б Р, 0 S, В стехиометрических расчет допускается пренебрегать малоколичественными элементами (S). Для расчетов принимают молекулярную массу такой, чтобы в ней оказался I атом углерода. Для этого поделим на 442: CH1,8O0,3N0,24.
4. Производим расчет С-моля биомассы бактерий:
Mс-моль=пс ММС +п н ММ н + n 0 ММ 0 + n N ММ N (4.2).
ММS с-моль=l *12+1.8* 1+0.5* 16+0.2* 14=30.
Расчет С-моля субстрата определяют исходя из формулы амилазы (С6Н1206)n так же как и для С-моля биомассы по формуле (4.2). После деления коэффициентов на 6 она имеет вид: (СН2O)n (4.3). Тогда молекулярная масса С-моля амилазы равна:
ММБМ смоль=1 *12+1,8*1+0,5*16+0,2*14=24,6.
5. Определяем теоретический выход биомассы по формуле:
Y = ММS c-моль/ММБМс-моль (4.4).
Подставив численные значения, получим: УБМ=24,6/30=0.85.
6. Для определения количества субстрата затрачиваемого биомассой на энергетические нужды рассчитываем энергетический выход биомассы по формуле:
?=гs/гx (4.5).
где г s, г xэнергия, заключенная в субстрате и биомассе соответственно.
Расчет величин гs и гл осуществляем, используя степень восстановленное™ по элементам углероду, водороду, кислороду, азоту.
7. Степень восстановленности С-моля амилазы рассчитаем по формуле:
гs=4m + 1n — 2р — 3q, (4.7).
где 4,1,2,3 — числа свободных электронов, соответственно С, Н, О, N; m, n, p, qиндексы атомов при углероде, водороде, кислороде, азоте соответственно.
Подставив численные значения, получим: Гs =4* 1+1 *2−2* 1=4.
Аналогично рассчитаем степень восстановления биомассы:
гs=4* 1 + 1* 1.8−2*0.5−3*0.19−3*0.2=4.2.
Рассчитаем энергетический выход:? =4/4.2=0.95.
От этой величины можно перейти к обычному выходу биомассы:
YБМ=? MMsс-моль/MMБМс-моль (4.9).
YБМ= 0.95*0.85=0.807.
8. Составляем стехиометрическое уравнение для синтеза биомассы бактерий, исходя из теоретического выхода биомассы Y БМ = 0.85, т. е. из 1 кг пектина образуется 0.807 кг биомассы. Общее стехиометрическое соотношение обмена веществ имеет вид:
v s [S]+ v02[O2]+ vNH3[NH3] >X + vp[P]+ vco2[СО2].
По рецептуре на долю углеродсодержащего сырья (кукурузной муки) приходится 2 кг с влажностью 10%. Доля СВ 1.8 кг. Количество амилазы составляет:
Х=(1.8*22)/100 = 0.396 кг, где 22 — содержание амилазы в кукурузной муке (в %).
Общий азот из кукурузного экстракта:
х = 0.9*7/100=0.063 кг, где 0.9 — масса кукурузного экстракта, кг,.
7 — содержание общего азота в кукурузном экстракте, в %.
Азот из (NH4)2 НРО 4: 0.8*28/132=0.169 кг, где 0.8 — масса соли, кг,.
132 — молекулярная масса соли, кг/кмоль.
+ 0.169 = 0.232 КГ.
9. Рассчитаем стехиометрические коэффициенты обмена веществ.
vs = 0.396/2=0.198.
vs=0.232/(0.45=0.8)=0.186.
vsns + vNH3 *3 = 1.58 + vpnp.
vp=(vsns+vNH3*3−1.8)/np.
vp = (0.198 * 7 + 0.186 *3 -1.8)/1256 = 0.0006.
vsms =1 + vpmp +vCQ2.
vco2 = vsms -1 — vpmp.
vC02 = 0.198 * 6 — 1 — 0.0006 * 510 = 0.178.
Общее стехиометрическое соотношение обмена веществ имеет вид:
198((С6H12O6)n) + 0.186(NH3)>CH1.8O 0.3N 0.24 +.
0006(C510H12560413N250) + 0.178(CO2).
7. Особенности применения продукта в производстве продуктов питания амилаза биотехнологический Амилазы находят применение почти во всех областях, где перерабатывается крахмалсодержащее сырьё. Амилазы используются для осахаривания зернового и картофельного крахмала. Самым большим потребителем амилолитических ферментов является спиртовая и пивоваренная промышленности, где в настоящее время солод (пророщенное зерно) успешно заменяется амилолитическими ферментными препаратами. Эти препараты используются в хлебопечении, а также в крахмалопаточном производстве для получения различных видов паток, глюкозы и глюкозофруктозных сиропов. Амилазы используются для улучшения качества концентратов и быстроразвариваемых блюд, большую перспективу представляют амилолитические ферментные препараты для промышленности, изготовляющей моющие средства. Там термостабильные и щелочеустойчивые амилазы могут быть прекрасной биологической добавкой для снятия углеводных загрязнений. Амилазы используются в текстильной промышленности для расшлихтовки тканей и приготовления высококонцентрированных клейстеров крахмала в процессе крашения тканей. В последнее время уделяется внимание использованию амилаз при переработке различных крахмалсодержащих отходов в кормовые белковые препараты. Высокоочищенные амилазы применяются для аналитических целей и в медицине.
В настоящее время большое внимание уделяется разработкам схем по применению концентрированных ферментных препаратов в хлебопечении. Показано, что ферментные препараты могут быть широко использованы в качестве улучшителей хлебопекарных свойств как пшеничной, так и ржаной муки. При добавлении препарата амилоризина П 10х в количестве 0,002- 0,004% к массе муки повышается удельный объём хлеба, существенно улучшаются физикомеханические свойства мякиша, становится более интенсивной окраска корки и более приятным вкус и аромат. Амилолитические препараты из Asp. oryzae и A. awamori оказывают положительное влияние на процесс приготовления заквасок и жидких дрожжей. В связи с улучшением бродильной активности заквасок и жидких дрожжей сокращается продолжительность брожения полуфабрикатов на 25- 30% и длительность расстойки при одновременном улучшении качества хлеба. Нельзя забывать о том, что в подавляющем большинстве случаев ферментные препараты представляют собой комплексы большого числа ферментов. При действии этих комплексов может присходить не только гидролиз крахмала, но и гидролиз других компонентов муки. С этой точки зрения весьма нежелательно присутствие в препаратах активных протеиназ. Отмечено, например, что протеиназа препарата П 10х Asp. Oryzae оказывает отрицательное воздействие на клейковину муки из мягких пшениц. В то же время она неоходима при переработке муки из твёрдых пшениц, когда воздействие фермента на недостаточно эластичную клейковину дает положительный эффект. В последнее время обращено внимание на использование в хлебопечении препаратов, содержащих активную глюкоамилазу. Особая роль отводится препаратам из Asp. Awamori и Rh. Delemar, содержащих малоактивную протеиназу.
В пивоваренном производстве главная задачаполучить высокий выход экстрактивных веществ из перерабатываемого сырья. Основным сырьём здесь является солод. Выход экстракта находится в тесной взаимосвязи с активностью гидролаз, образованных при солодоращении и со степенью растворения солода. Особенно велика роль амилаз. Она заключается в максимальном извлечении крахмала из солода и переводе этого субстрата и сбраживаемые углеводы. Однако в пивоварении в противоположность спиртовому производству не стремяться осахарить конечные декстрины. Они необходимы в сусле, поскольку в дальнейшем создают полноту вкуса пива, в определенной степени обуславливают его пеностойкость.
Гидролиз крахмала в сбраживаемые сахара (мальтозу, глюкозу) и конечные декстрины осуществляется в процессе затирания. Основными факторами, с помощью которых регулируют специфичность и интенсивность действия амилаз, являются температура и pH среды. Интервал температур 60- 65″ С является оптимальным для образования сбраживаемых сахаров. В интервале температур 70- 75″ С происходит быстрый перевод крахмала в экстракт с образованием большого количества декстринов. Регулируя продолжительность эти двух температурных фаз, можно добиваться оптимального соотношения между количеством сбраживаемых сахаров и декстринов, определенной степени сбраживания пива, его высокой коллоидной стойкости и пеностойкости. Важное значение здесь имеет не только активность амилаз солода, но и их различная термостабильность.
Существенное влияние на гидролиз крахмала при затирании окозывает концентрация Н — ионов. При высоких значениях pH (6,2−6,5) скорость гидролиза крахмала уменьшается, замедляется фильтрация сусла, а пиво становится менее стойким при хранении. Оптимальным pH при затирании следует считать 5,3- 5,6, чего можно достичь внесением в затор молочной кислоты.
Список используемой литературы.
1. Иванова А. А. Л. И. Войно, И. С. Иванова. Пищевая биотехнология. М.: Колос С, 2008 — 427 с.
2. Грачева И. М. Технология ферментных препаратов — М.: Агропромиздат., 2008 — 358с.
3. Бирюков В. В. Основы промышленной биотехнологии: Учеб. пособие для вузов. — М.: Колосс, 2004.
4. Кислухина О. В. Ферменты в производстве пищи и кормов. Издательство: М.: ДеЛи принт, 2002 г.
5. Кулев Д. Х., Шарова Н. Ю. Биосинтез и выделение лимонной кислоты и амилолитических ферментов. Издательство. М., ДеЛи принт, 2008.
6. Сайты: Биотехнология, Ферменты.
7. Патенты РФ, источник — www.fips.ru.