Основной принцип пептидного синтеза

Образование пептидной связи в случае дипептида является простым химическим процессом. Дипептид формально получается при отщеплении молекулы воды от аминои карбоксильной групп двух аминокислот (рис. 4). Последовательное повторение этого процесса, казалось бы, должно привести к длинным пептидам и даже к белкам. Однако реализация этого принципа возможна только в жестких условиях неконтролируемой реакции. Основатель пептидной и белковой химии Э. Фишер в 1906 г. писал: «Если бы сегодня по счастливой случайности с помощью какой-то жесткой реакции, например при сплавлении аминокислот в присутствии водоотнимающих средств, удалось получить настоящий белок и если бы, что еще менее вероятно, можно было искусственно созданный продукт идентифицировать с естественным, то это ничего не дало бы ни для химии белков, ни для биологии».

Рис. 6. Основной принцип пептидного синтеза

Образование пептидной связи в мягких условиях удается лишь при активировании карбоксильного компонента одной из аминокислот, вступающей в реакцию (рис. 6).

Вторая аминокислота В (аминокомпонент) атакует активированный карбоксильный компонент аминогруппой с образованием пептидной связи. Незащищенная аминофункция карбоксильного компонента, А тоже может реагировать, что приводит (рис. 7) к нежелательным побочным продуктам — линейным и циклическим пептидам. Из этого следует вывод, что для однозначного течения пептидного синтеза следует временно блокировать все функциональные группы, не участвующие в образовании пептидной связи[3].

Рис. 7. Схема образования пептидной связи без защиты не участвующих в реакции функциональных групп

Пептидный синтез, т. е. образование каждой пептидной связи, является поэтому многоступенчатым процессом. В первую очередь получают частично замещенные аминокислоты, при этом они одновременно теряют цвиттер-ионную структуру. Вторая ступень, собственно образование пептидной связи, протекает в две стадии. Сначала нужно активировать N-защищенный карбоксильный компонент. Затем происходит собственно образование пептидной связи, которое протекает либо одноступенчато (вместе с активированием), либо последовательно в следующую стадию. На третьей ступени защитные группы селективно отщепляются, причем полученные частично защищенные производные дипептидов могут использоваться для дальнейших синтезов как карбоксильные или аминокомпоненты. Само собой разумеется, что в случае синтеза дипептида обе защитные группы удаляются одновременно. Пептидный синтез, далее, усложняется еще и тем, что из 20 протеиногенных аминокислот 9 обладают еще третьей функциональной группой, которая также требует селективной защиты. Это Ser, Thr, Туг, Asp, Glu, Lys, Arg, His и Cys. Следует различать временные и постоянные защитные группы. Временные защитные группы служат для защиты концевых аминои карбоксильных групп и должны поэтому селективно отщепляться в присутствии постоянных защитных групп. Постоянные защитные группы удаляются обычно только после окончания синтеза пептида или же иногда на стадии промежуточного продукта. Активирование карбоксильного компонента и следующее за ним образование пептидной связи, т. е. так называемая реакция конденсации, в идеальных условиях должны протекать с высокой скоростью без рацемизации, без побочных реакций и с высоким выходом при соединении эквимолярных количеств карбоксии аминокомпонентов. К сожалению, в настоящее время еще неизвестно такого метода конденсации, который удовлетворял бы всем этим требованиям. Приходится выбирать из относительно большого набора методов подходящие варианты в соответствии со специфическими целями синтеза. Решение зависит в каждом случае от выбранной тактики синтеза, в соответствии с которой для каждого отрезка синтезируемой последовательности подбираются оптимальные методы конденсации. Набор методов, которые применяются для практического проведения синтеза пептидов, относительно мал по сравнению с примерно 130 описанными методами синтеза. На последней ступени пептидного синтеза происходит отщепление защитных групп. Поскольку синтез дипептида с полным удалением защитных групп проводится довольно редко, гораздо большее значение имеет селективное деблокирование, т. е. выборочное отщепление защитных групп N-концевой аминофункции или же С-концевой карбоксильной группы. Этот вопрос находится в тесной связи с общим планом синтеза.

Под стратегией понимают последовательность связывания аминокислотных компонентов в пептид, причем следует различать постепенное наращивание и фрагментную конденсацию. Получение полипептидов путем постепенного наращивания цепи трудноосуществимо при больших размерах целевой молекулы. В этих случаях большое значение приобретает разделение объекта синтеза на отдельные фрагменты с последующим соединением их в полипептид. Оптимальный выбор комбинации защитных групп и применение подходящего метода конденсации для каждого отрезка составляет предмет тактики пептидного синтеза.

Стратегическую модификацию постепенного наращивания пептидов или белков представляет разработанный в 1963 г. Меррифилдом пептидный синтез на полимерных носителях. Несмотря на сенсационный успех этого метода (синтез протекает в двухфазной системе и есть возможиость его автоматизации), возлагаемые на него большие ожидания до сих пор полностью не исполнились.