Материал и методика

Исследована кровь 65 — ти больных алкоголизмом в возрасте от 25 до 55 лет, госпитализированных в отделение неотложной наркологической помощи (ОННП) Областной наркологической больницы г. Пенза. Кровь 6 клинически здоровых людей применялась для анализа в качестве контроля. Исследуемых распределяли по группам в соответствии с различными проявлениями заболевания:

группа 1 — больные алкоголизмом с выраженными симптомами проявления алкогольного делирия (АД) группа 2 — больные алкоголизмом с выраженными симптомами проявления алкогольно-абстинентного синдрома (ААС) группа 3 — больные хроническим алкоголизмом с выраженными соматическими проявлениями (обострение хронических заболеваний, гепатоз, гепатит) группа 4 — больные, прошедшие курс комплексной терапии (инфузионная, антиседативные препараты, витамины, ноотропы, гепатопротекторы) контроль — группа клинически здоровых людей.

При исследовании уровня МСМ сыворотки крови обычно используется осаждение сывороточных белков трихлоруксусной кислотой (ТХУ) [6] с последующим определением индекса интоксикации (ИИ) во фракциях по формуле:

.

Этот показатель коррелирует с тяжестью интоксикации при различных патологиях [10].

Нам представлялось интересным исследовать влияние МСМ на активность карбоксипептидаз, но оказалось, что ТХУ полностью ингибирует эти ферменты. Для получения фракций МСМ, не содержащих ТХУ, мы использовали 2 способа — диализ ТХУ — фракции сыворотки крови (ТХУ — МСМ) и удаление сывороточных белков после их тепловой денатурации (t — МСМ).

Получение фракций «t — МСМ»: сыворотку крови разбавляли буферным раствором (использовался 0,05 М натрий — ацетатный (NaAc) буферный раствор с 0,05 М NaCl) 1: 1, кипятили в течение 15ґ с последующим центрифугированием (4000 об/мин 15ґ) и отделением супернатанта. Фракции «ТХУ — МСМ» получали осаждением белков сыворотки равным количеством 6,6% ТХУ с центрифугированием (7000 об/мин, 30ґ) и диализом супернатанта в 0,05 М NaAc буферном растворе с 0,05 М NaCl, рН 5,6 в течение 3−5 часов. Изменения объёма проб после диализа не наблюдалось. Уровень содержания МСМ во фракциях определяли спектрофотометрически (СФ — 2000, л=280 нм, л=260 нм. ().

В методике определения активностей ферментов (Табл.1.) использовался 0,05 М натрий — ацетатный (NaAc) буферный раствор с 0,05 М NaCl.

При исследовании активности ФМСФ — КП источником фермента служил 1% гомогенат печени крыс. Активность фермента определяли по отношению к флуоресцирующему субстрату дансил-Phe-Leu-Arg, в качестве селективного ингибитора использовали 25 мМ спиртовой раствор фенилметилсульфонилфторида.

Источником КП Н служил 1% гомогенат мозга крыс, 0,625 мкМ водный р — р гуанидиноэтилмеркаптоянтарной кислоты — селективный ингибитор КП Н, субстрат для фермента — дансил-Phe-Ala-Arg.

Таблица 1.

Схема определения активности ферментов.

Концентрацию продукта реакции определяли, измеряя флуоресценцию хлороформной фазы (л_ex=360нм, л_em=530нм).