Фенотипирование нормальных и мутантных аллелей альфа-1-антитрипсина в сыворотке крови

ФЕНОТИПИРОВАНИЕ НОРМАЛЬНЫХ И МУТАНТНЫХ АЛЛЕЛЕЙ АЛЬФА 1-АНТИТРИПСИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Исмайлова А.Б.

Используя метод изоэлектрофокусирования сывороточных белков крови проведено фенотипирование нормальных и мутантных Pi аллелей альфа-1-антитрипсина в одном из регионов Азербайджана. Идентифицировано три фенотипа PiМ аллелей (М1, М2 и М3) как в гомозиготном так и в компаундном состояниях. У трех членов одной семьи идентифицирован мутантный PiZ аллель в гетерозиготном состоянии.

Альфа 1-Антитрипсин (А1АТ) — низкомолекулярный протеазный ингибитор, подавляющий активность многих сериновых протеолетических энзимов: трипсина, химотрипсина, плазмина, тромбина, нейтрофильной эластазы, гиалуронидазы, тканевого калликреина, фактора Ха, плазминогена, протеаз лейкоцитов, макрофагов, микроорганизмов и др. (1,3).

Дефицит А1АТ приводит к дисбалансу в системе протеолиз-антипротеолиз (4). А1АТ кодируется геном Pi (proteinase inhibitor), расположенным на длинном плече 14-й хромосом. При воспалении нейтрофилы проникают в стенку бронхов, альвеолярное пространство, при этом за счет нейтрофильной эластазы значительно возрастает протеолитическая активность бронхиального секрета и требуется большое количество ингибиторов протеаз. Активность А1АТ на поверхности эпителиальных клеток дыхательных путей составляет около 10% от ее сывороточного уровня. При дефиците ингибиторов протеаз происходит протеолитическое разрушение эластических структур легочной ткани (2,5−13).

В настоящее время известно 90 аллелей гена Pi; они подразделяются на четыре группы: нормальные с физиологическим уровнем А1АТ в сыворотке крови и дефицитные — концентрация А1АТ снижена минимум до 65% от нормы; «нулевые» — в сыворотке ингибитор не определяется и, в сыворотке регистрируется нормальный уровень ингибитора, но его активность по отношению к эластазе снижена (11).

Для идентификации фенотипов А1АТ использовали метод аналитического изоэлэктрофокусирования на полиакриламидно-амфолиновых гелях с рН 4−6 (12).

Материал — капиллярная кровь для исследований собран в экспедиционных условиях в Центральной Районной Больнице и в селах Еникенд, Тугай, Бешдам и Гыл-Гыл чай Сиязаньского района Азербайджанской Республики в 2004;2005 гг. Также исследована сыворотка крови от 50-ти доноров в количестве 0,5−1мл. Забор капиллярной или же венозной крови производили в микропробирки «эппендорф» без антикоагулянта. Сыворотку получали путем центрифугирования крови в центрифуге «эппендорф» (при 12 000 об/мин) в течение 10−15 секунд. Перед изоэлэктрофокусированием сыворотку разбавляли 1: 5 дистиллированной водой.

Для анализа использовали полиакриламидно-амфолиновые пластинки следующего состава: 2,7 мл акриламид/бисакриламид, 0,5 мл HCL/трис буфер (3,03 г трис растворяли в 80 мл дистиллированной воде и с помощью соляной кислоты доводили рН до 8,4; количество буфера доводили до 100 мл с помощью дистиллированной воды), 1 мл глицерол, 100 мкл амфолина рН 4−6, 100 мкл амфолина рН 3,5−9,5, 10 мкл ТЕМЕД, 20 мкл аммониум персульфат (400 мг аммониум персульфат + 1 мл дистиллированной воды). Рабочий раствор в вышеперечисленном порядке добавляли в химический стакан, перемешивали, а затем, для полимеризации раствор наливали между двумя стеклами размером 110×260 мм. Полимеризация происходила в течение 2−3-х часов. После образования геля одно из стекол удаляли, и гель клали на охлаждаемую поверхность аппарата «Multiphore» фирмы Амершам (США). Систему охлаждали до 10оС с использованием термостата Multi Temp III. Время анализа длится 1,5−2 часа. Напряжение 1500 вольт получали с помощью источника питания — Electrophoresis Power Supply — EPS 3501 XL. Для фиксации сывороточных белков после изоэлектрофокусирования полиакриламидно-амфолиновый гель помещали в 40%-й раствор этилового спирта на 10−15 минут, затем для удаления амфолитов гель несколько раз промывали 7%-ым водным раствором уксусной кислоты. После этого сывороточные белки окрашивали 2%-м раствором Кумасси G в течение 10 минут и остаток красителя удаляли 7%-ным раствором уксусной кислоты. Гель для сохранности высушивали и покрывали полиэтиленовой пленкой.

В сыворотке донорской крови наблюдали все три фенотипа всех трех нормальных Pi аллелей альфа 1-антитрипсина: М1, М2 и М3, в гомозиготном (М1М1, М2М2 и М3М3) и в двойном гетерозиготном — компаундном состояниях (М1М2, М1М3 и М2М3).

Частота М1 и М2 аллелей была одинаковой — 38%, тогда как для гена М3 составила — 24%. Следовательно, гомозиготные фенотипы, связанные с этими аллелями, преобладали: М1М1 — 16% и М2М2 — 12%. Среди компаундов преобладали фенотипы: М1М2 — 32%, М2М3 — 20%.

Частота генотипов — М1М2, М2М3 и М1М3 составили — 32%, 20% и 12%, соответственно.

В одной семье у трех членов идентифицирован в гетерозиготном состоянии мутантный PiZ аллель.

Таким образом, используя метод изоэлектрофокусирования в полиакриламидно-амфолиновых пластинках (рН 4−6) проведено фенотипирование нормальных и мутантных аллелей А1АТ.

фенотипирование мутантный аллель кровь.

• 1. Abbound R.T., Rushton J.M., Grzybowski S. Interrelationships between neutrophil elastase, serum alpha 1-antitrypsin, lung function and chest radiography in patients with chronic airflow obstruction. Am Rev Respir Dis., 1979 Jul; 120(1), p. 31−40
• 2. Audrain M.A. et al. Analysis of anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA): frequency and specificity in a sample of 191 homozygous (PiZZ) alpha 1-antitrypsin-deficient subjects. Nephrol Dial Transpalnt., 2001 Jan; 16 (1), p. 39−44
• 3. Coakley R.J. et al. Alpha 1-antitrypsin deficiency: biological answers to clinical questions. Am J Ned Sci., 2001 Jan; 321 (1), p. 33−41
• 4. Elzouki A. N et al. Severe alpha 1-antitrypsin deficiency (PiZ homozygosity) with membranoproliferative glomerulonephritis and nephritic syndrome, reversible after orthotopic liver transplantation. J Hepatol., 1997 Jun., 26 (6), p. 1403−7
• 5. Gross V. et al. Biosynthsis and secretion of Mand Z-type alpha 1-proteinase inhibitor by human monocytes. Effect of inhibitors of glycosylation and of oligosaccharide processing on secretion and function. Biol Chem Hoppe Seyler., 1990 Mar; 371 (3), p. 231−8
• 6. Janciauskiene S. et al. Detection of calculating and endothelial cell polymers of Z and wild type alpha 1-antitrypsin by a monoclonal antibody. J. Bio Chem., 2002 Jul 19, 277(29), p. 26 540−6
• 7. Malerba M. et al. Exhaled nitric oxide in patients with PiZZ phenotype-related alpha 1 antitrypsin deficiency. Respir Med., 2001 Aug; 95 (8), p. 699
• 8. Perlmutter D.H., Travis J., Punsal P.I. Elastase regulates the synthsis of its inhibitor, alpha 1-proteinase inhibitor, and exaggerates the defect in homozygous PiZZ alpha 1 PI deficiency. J Clin Invest., 1988 Jun; 81(6), p. 1774−80
• 9. Piitulainen E. and Sveger T. Respiratory symptoms and lumg function in young adults with severe alpha (1)-antitrypsin deficiency (PiZZ). Thorax, 2002 Aug; 57 (8), p. 705−8
• 10. Stokley R.A.and Afford S.C. The effect of leucocyte elastase on the immunoelectrophoretic behaviour of alpha 1-antitrypsin. Clin Sci (Lond), 1984 Feb; 66 (2), p. 217−24
• 11. Vandivier R.W. et al. Elastase-mediated phosphotidylserine receptor cleavage impairs apoptotic cell clearance in cystoc fibrosis and bronchiectasis. J Clin Invest., 2002 March; v. 109, # 5, p. 661−670
• 12. Westermeier R. Electrophoresis in practice. A guide to methods and applications of DNA and protein separations. Third edition. Weinheim, Germany, 2001
• 13. Wilson J. S. et al. Normal Diffusing capacity in patients with PiZ alpha 1-antitrypsin deficiency, severe airflow obstruction, and significant radiographic emphysema, J Clin Invest., 2002 March; v. 109, # 5, p. 650−654