Усовершенствование процесса лиофильного высушивания иммунобиологических препаратов на современном оборудовании

Значительная часть иммунодиагностических препаратов на одном из заключительных этапов производства подвергаются лиофильному высушиванию. Этот технологический этап позволяет стабилизировать свойства препарата и многократно увеличить срок его хранения. Однако, подбор параметров лиофилизации в каждом конкретном случае является сложной технологической задачей. Так как этот процесс связан с изменением агрегатного состояния препарата, он напрямую влияет на его иммунологическую активность и возможность длительного хранения.

Сам процесс лиофилизации — переход связанной и свободной влаги вещества из кристаллического состояния в газообразное, минуя жидкую фазу — возможен только при определенных физических условиях (температуры и вакуума), обусловленных природой и свойствами воды. Принципы вакуум-сублимационной сушки описаны в основополагающих трудах по лиофилизации [3, 4]. Одним из основных параметров лиофилизации является скорость высушивания, которая зависит от глубины вакуума, температурного режима и времени прохождения различных этапов процесса высушивания.

Кроме того, каждый препарат имеет так называемую температуру эвтектики (кристаллизации, коллапса), которая зависит от природы, состава, концентрации и других параметров лиофилизата. Эта температура обусловлена внутренними параметрами кристаллизации льда связанной влаги препарата. В основном, для белковых иммунобиологических препаратов она не выше — (25±5)^оС. Есть мнение, что для тонких белковых структур нельзя превышать эту температурную границу во время процесса лиофилизации до тех пор, пока вся свободная влага не будет удалена из препарата [2].

Процесс лиофилизации проходит под вакуумом и связан с удалением (испарением) кристаллов воды (сублимацией), минуя жидкую фазу. Как известно из физики, этот процесс сопровождается понижением температуры, и чем он интенсивнее, тем сильнее охлаждение препарата. Таким образом, охлаждение препарата напрямую зависит от глубины вакуума в камере.

Существует метод замораживания продукта перед лиофилизацией без использования холодильной техники — путем помещения его в вакуум. Метод достаточно «жесткий», связан со вспениванием продукта и, как правило, ведет к снижению биологической активности продукта. Для диагностических и эритроцитарных препаратов не используется [1].

С целью компенсации явления снижения температуры во время высушивания подводится дополнительное тепло — тем или иным способом. Чаще всего это электроподогрев полок в камере сублимационной установки или естественный приток тепла из окружающей среды (радиационный метод) при отсутствии рабочей камеры, когда колбы или ампулы присоединяются к установке с помощью специальных магистральных штанг, зажимов и вакуумных рукавов и находятся снаружи. В последнем случае процесс и его скорость зависят от температуры помещения, где производится сушка.

Следует отметить, что все температурные перепады как во время подготовки к лиофилизации (замораживания), так и во время самой сушки небезразличны для препарата и его активности. Более того, именно от них (резких скачков температуры), как показывает практика, и зависит окончательный результат лиофилизации и нативность препарата (сохранность первоначальных свойств) после регидратации.

По данным литературы замораживание продукта перед лиофилизацией должно вестись при температурах от -40 до -60^оС [5].

Экспериментальным путем, после проведения научно-исследовательских и технологических изысканий было выявлено, что наиболее оптимальным режимом сублимационной сушки для эритроцитарных диагностикумов является плавное повышение температуры продукта от -40^оС (температура замораживания) до комнатной температуры (22±2)^оС без всяких скачков и перепадов при постепенном снижении вакуума от 400 мк рт.ст. до 150 (т.е. от 50 до 20 Па.).

Условия сублимации иммунобиологических препаратов на современном оборудовании отличаются от традиционных сублимационных установок возможностью использования режимов глубокого вакуума до 10- 15 мк рт. ст. (до 1 Па) — а это на порядок выше, чем в сушках предыдущего поколения. Новые технологии позволяют значительно ускорить процесс. Однако при этом ускоренная сублимация несвязанной влаги вызывает значительное охлаждение препарата и по окончании выхода этой влаги возникает резкий скачок на графике сушки препарата — температура начинает повышаться с большой скоростью, что приводит к значительному или полному снижению иммунологической активности высушенных препаратов (Рис. 1).

лиофильный сушка препарат сублимационный.

Рис 1. График лиофилизации препарата при глубоком ваккуме (1 — температура препарата; 2 — давление в камере).

Цель работы Определение параметров лиофилизации иммунодиагностических эритроцитарных препаратов для максимально возможного сохранения активности продукта после сушки и регидратации.

Методика исследования В качестве объекта лиофилизации был выбран эритроцитарный сапной и мелиоидозный иммуноглобулиновый диагностикум производства ФКУЗ ВолгоградНИПЧИ, который достаточно лабилен и склонен к снижению активности после лиофилизации из-за наличия нестойкой связи сывороточных иммуноглобулинов с поверхностью эритроцитов и особенностей структуры клетки самого эритроцита.

Активность препаратов определяли в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), согласно инструкции по применению диагностикума. Определения проводили до и после лиофилизации в трехкратных повторах.

Лиофилизацию диагностикума проводили на установке COOLSAFE -100−9 фирмы «SCANLAF» (Дания) с вакуумным насосом RZ-1 фирмы «VACUUBRAND» .

Лиофильная установка позволяла проводить лиофилизацию по специальной программе, состоящей из 10 ступеней и была дополнительно оборудована блоком автоматического регулирования вакуума производства фирмы — изготовителя.

Результаты и обсуждение В результате проведенных исследований было установлено следующее.

• 1. Объект лиофилизации был выбран обоснованно, т.к. любые, даже незначительные отклонения от оптимального режима вызывали его частичную (на 2−3 лунки и более) потерю активности или полную непригодность из-за нарушения работы контролей в реакции РНГА. Об этом же свидетельствует тот факт, что, несмотря на многочисленные изыскания, до сих пор не найден способ лиофилизации донорской крови, позволяющий полноценно использовать ее после регидратации.
• 2. Для сохранения исходной активности препарата требуется плавное, без скачков, изменение температуры от температуры эвтектики препарата или несколько ниже (в нашем случае это -31^оС) до комнатной температуры (22±2)^оС, причем время выхода препарата на температуру 0^оС не должна быть менее 12 часов.
• 3. Избежать потери активности препарата можно лишь одним путем — снижением интенсивности сублимации. Для этого вакуум в камере установки необходимо уменьшить до 30−35 Ра на первоначальном этапе сушки, пока температура не пройдет порог эвтектики. Далее вакуум можно постепенно увеличивать.

Для обеспечения такого режима сушки на используемой установке нами была разработана следующая программа:

При этом обеспечивался режим плавного подъема температуры препарата на всем протяжении лиофилизации и переход через 0^оС за время около 12 ч (Рис 2). Следует отметить, что задаваемая температура полки значительно отличается от температуры препарата из-за испарения кристаллов льда, особенно на первых стадиях лиофилизации, когда препарат содержит большое количество несвязанной влаги. Для контроля истинной картины лиофилизации датчик температуры был размещен в препарате.

Рис 2. График лиофилизации препарата при умеренном вакууме

(1- температура препарата; 2 — давление в камере).

Чувствительность высушенных препаратов в РНГА не изменялась после сушки и составляла, как и перед лиофилизацией 4· 105 -8· 105 м.т./мл, при наличии четких контролей.

Заключение

Разработан режим бережной лиофилизации лабильных эритроцитарных диагностикумов, позволяющий использовать его для производства медицинских иммунобиологических препаратов на современном сублимационном оборудовании.

1. Антипов С. Т., Игнатов В. Е., Эйхаб Хасан, Востриков С. В.,

Шахов С. В. Способ циклической вакуум-сублимационной сушки. Патент RU № 2 119 625 C1 МПК 6 F26B5/06, опубликовано: 27.09.1998.

• 2. Бердоносов С. С., Горелик А. Г. Сублимация в современных химических технологиях: проблемы и достижения // Химическая промышленность. 1993. № 8. С. 391−398.
• 3. Ф. Герхардт. Методы общей бактериологии. Том 1, М.: Мир, 1984. — 1272 с.
• 4. Камовников Б. П., Малков Л. С., Воскобойников В. А. Вакуум-сублимационная сушка пищевых продуктов (Основы теории, расчет и оптимизация). — М.: Агропромиздат. — 1985. — 288 с.
• 5. Шалаев Е. Ю., Франкс Ф., Вараксин Н. А., Рукавишников М. Ю. Способ лиофильной сушки биопрепарата. Пат. RU 2 111 426, F26 b5/06, опубл. 20.05.1998.