Введение. 
Ферменты генетической инженерии

Осуществить рекомбинацию негомологичных молекул ДНК in vitro стало возможно лишь после открытия в конце 1960;х — начале 1970;х гг. ряда новых ферментов с уникальными свойствами, имеющих в качестве субстратов катализируемых ими реакций нуклеиновые кислоты, и в первую очередь ДНК.

Ферменты генетической инженерии — это ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности, и т. д. Рассмотрим основные свойства ферментов, наиболее часто используемых в генно-инженерных работах.

Рестриктазы

Ферменты этого типа были открыты в результате подробного изучения механизма явления, получившего название «рестрикция, контролируемая хозяином». В 1950;х гг. в нескольких лабораториях, изучавших развитие фагов в бактериальных клетках, было установлено, что способность бактериального вируса расти на определенных бактериальных культурах может зависеть от штамма, в котором этот фаг размножался в последний раз.

Наиболее подробно данное явление изучено для бактериофага лямбда л. Природным хозяином лямбды л является кишечная палочка Escherichia coli К12. Фаг, выросший на этом штамме, обозначают л. К. Другим хозяином фага л может быть штамм Е. coli С. Фаговое потомство, полученное на этой бактериальной культуре обозначают л С. В1953 г. Г. Бертани и Дж. Уэйгл обнаружили, что фаг л С размножается в клетках Е. coli К12 с очень низкой эффективностью, в то время как на Е. coli С — хорошо.

Эффективность размножения фага определяли титрованием его препарата на газоне бактериальных клеток. Данная процедура заключается в том, что к суспензии клеток добавляют определенное количество фагового препарата и затем эту смесь равномерно наносят на прозрачную агаризованную питательную среду в чашках Петри. Через определенное время клетки образуют на поверхности твердой среды мутную пленку газона (сплошного роста) бактериальной культуры. В тех местах, где находились клетки, инфицированные фагом, возникают прозрачные зоны лизиса, называемые обычно бляшками или негативными колониями. Подсчитав число бляшек и зная количество фагового препарата, которое обусловило образование этих бляшек, можно вычислить титр жизнеспособных фаговых частиц в анализируемом препарате. Титр фага выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл (БОЕ/мл).

Обнаружилось, что эффективность титрования л С на Е. coli К12 составляла лишь 2 относительно того же показателя на Е. coli С. Однако немногочисленное потомство фага л С, выросшее на Е. coli К12, уже с одинаковой эффективностью титровалось на обоих штаммах Е. coli. Было показано, что фаг л К не является генетическим мутантом фага л С. Поэтому предположили, что л К представляет собой модифицированный вариант фага л С и этй модификацию осуществляет клетка-хозяин.

Эксперименты с радиоактивно меченными бактериофагами показали, что ограничение роста (рестрикция) фага связано с ферментативной деградацией его ДНК в бактериальной клетке. Клеточная ДНК защищена от деградации щтаммоспецифичной модификацией, которая, как выяснилось, состоит в метилировании нуклеотидов. Эти результаты позволили выдвинуть исчерпывающую гипотезу о биохимических механизмах рестрикции и модификации.

Гипотеза оказалась плодотворной, и открытие ферментов рестрикции — эндодезоксирибонуклеаз, или рестриктаз, и ферментов модификации — ДНК-метилтрасфераз, часто называемых ДНК-метилазами, полностью ее подтвердило.

Таким образом, при инфицировании немодифицированным фагом л С клеток Е. coli К12 происходит одновременное расщепление фаговых молекул ДНК рестриктазой и метилирование их ДНК-метилазой. В результате конкуренции этих двух ферментативных процессов часть молекул ДНК фага л (2) успевают модифицироваться прежде, чем они подвергнутся нуклеазной атаке. Такая метилированная ДНК дает начало модифицированному фаговому потомству л К. Данная модификация не наследуется фагом, и при размножении л К на Е. coli С образуется фаговое потомство, ДНК которого снова неметилирована.

Рестриктазы узнают определенные последовательности нуклеотидов и разрезают двунитевую ДНК на фрагменты. Модификация заключается в метилировании определенных оснований в последовательности, узнаваемой сопряженной рестриктазой; тем самым обеспечивается защита данного участка ДНК от воздействия рестриктазы. Одновременное наличие в клетке этих двух ферментативных активностей (так называемая R-M система) препятствует гидролизу собственной нуклеиновой кислоты. Чужеродная же ДНК при проникновении в бактериальную клетку служит субстратом для обоих ферментов.

Первоначально многие считали, что единственной функцией R-M систем является защита клеток от инфицирования фагами. Однако дальнейшие исследования позволили сделать предположение о том, что R-M системы осуществляют функцию ограничения скрещивания между различными бактериальными видами и штаммами, которая, однако, не абсолютна и позволяет части чужеродной ДНК проникать в клетку, рекомбинационно встраиваться и поддерживаться в качестве генетического фонда для получения эволюционного преимущества. Уместно заметить, что у бактерий весьма проблематично определение вида. Существуют даже предположения об общем генофонде всех микроорганизмов, что должно было бы привести к бесконечному появлению новых видов бактерий во времени. Реально же мы видим, что бактерии проявляют определенное постоянство морфологических, генетических и биохимических характеристик. Достойными кандидатами для обеспечения относительной стабильности генетического материала, т. е. для осуществления генетической изоляции, не отрицающей обмена определенными блоками, являются системы рестрикции модификации.

В 1968 г. М. Мезельсон и Р. Юань сообщили о выделении первой рестриктазы из штамма Е. coli К12. Подобный фермент был получен и из штамма Е. coli В. Данные эндонуклеазы ЕcoК и ЕcoВ отличались высокой специфичностью по отношению к узнаваемой последовательности нуклеотидов, но расщепляли молекулы ДНК неспецифически в другом месте, отстоящем от участка (сайта) узнавания. В 1970 г. Х. Смит и К. Вилькокс выделили из Haemophius influenza рестриктазу HindII, не только специфически узнающую, но и специфически расщепляющую молекулы ДНК. При гидролизе вирусной или плазмидной ДНК рестриктазами такого типа образуется строго определенный набор фрагментов. Это наглядно выявляется при электрофоретическом разделении смеси получающихся фрагментов.

Принципиальное значение для разработки методологии генетической инженерии имело открытие в 1971 г. Р. Ёшимори рестриктаз ЕcoRI и ЕcoRII. С помощью первой из них удалось выполнить пионерскую работу по направленной реконструкции генетического материала in vitro. В настоящее время рестриктазы используют практически во всех генно-инженерных экспериментах. Такое широкое применение ферментов данного типа обусловлено их высокой специфичностью, а также особенностями структуры концов фрагментов ДНК, образуемых рестриктазами. Общепринято термины рестриктаза, эндонуклеаза рестрикции, сайтспецифическая эндодезоксирибонуклеаза считать синонимами.

Х. Смит и Д. Натас в 1973 г. предложили номенклатуру рестриктаз, которая включает следующие пункты:

• 1. Название каждого фермента является производным от бинарного родовидового обозначения микроорганизма-хозяина, содержащего данную R-M систему, и составляется по следующему правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида.
• 2. За родовидовым названием следует, в случае необходимости, обозначение серотипа или штамма.
• 3. Различные системы рестрикции-модификации, кодируемые одной и той же бактериальной клеткой, обозначаются римскими цифрами.
• 4. Ферменты рестрикциимодификации в общем виде обозначаются как эндонуклеаза R или метилаза M с последующим определением названия системы.
• 5. Если система генетически локализована в геноме фага или на плазмиде, то после родовидового названия указывается символ внехромосомного элемента. Штаммовая принадлежность в этих случаях указывается в скобках.

Открытие большого числа рестриктаз и изучение их свойств позволило выявить некоторые закономерности функционирования ферментов и разделить их на три класса. Основной классификации служат в первую очередь потребность фермента в кофакторах и характер расщепления ДНК.

Наиболее изученными рестриктазами класса 1 являются ферменты ЕcoК и ЕcoВ, выделенные соответственно из клеток Е. coliК12 и Е. coli В. Это ферменты с очень схожей структурой. Оба содержат три типа неидентичных субъединиц с молекулярной массой 135,60 и 50 кДа, хотя соотношение субъединиц различается для этих двух ферментов. В случае ЕcoВ ситуация более сложная, так как выявлены по крайней мере три активные олигомерные структуры. Основная из которых имеет состав б2в4Y2.

Рестриктазы класса 1 специфичны к немодифицированной двухцепочечной ДНК и обладают следующими свойствами: требуют в качестве кофакторов аденозинтрифосфат (АТР), S-аденозинмонофосфат. Расщепление ДНК совмещено с гидролизом АТР. В едином субъединичном белке имеются такие ферментативные активности, как расщепление ДНК, метилированные ДНК и узнавание специфической последовательности ДНК.

Однако разрыв ДНК происходит случайным образом на значительном расстоянии от участка узнаванияот 400 до 7000 пар нуклеотидов. Продукты расщепления ДНК гетерогенны.

Ф. Студиэр и П. Бэндепедхяй в 1988 г. На основе подробного изучения гидролиза ДНК фага Т7 рестриктазой ЕcoК предложил общую модель действия рестриктаз класса 1 на ДНК. Суть этой модели состоит в том, что рестриктаза класса 1 после взаимодействия с ДНК в участке узнавания начинает осуществлять АТРзависимую транслокацию цепей ДНК через себя в обоих направлениях. При встрече двух соседних молекул фермента, транслоцирующих ДНК, они разрезают двухцепочечную ДНК в районе контакта. Гетерогенность продуктов гидролиза ДНК рестриктазами класса 1 может объясняться неодновременным случайным взаимодействием молекул фермента с разными участками узнавания на каждой молекуле ДНК, а следовательно, неодновременным началом транслокации цепей ДНК. Кроме того, не исключена возможность неравномерной транслокации цепей на разных молекулах препарата ДНК.

Системы рестриктации-модификации класса 2 состоят из отдельных белков рестрикционной эндонуклеазы и модификационной метилазы. Поэтому рестриктазы данного класса можно выделить в индивидуальном состоянии, свободном от метилазной активности, что в значительной мере упрощает их изучение и последующее использование для расщепления молекул ДНК.

Рестриктазы класса 2 — относительно просто организованные белки, состоящие из двух субъединиц одного типа со сравнительно небольшой молекулярной массой. Отличительной чертой рестриктаз класса 2 является то, что они узнают и разрезают немодифицированную двухцепочечную молекулу ДНК по специфичным нуклеотидным последовательностям, и это приводит к образованию дискретного набора фрагментов анализируемой ДНК. Для специфического действия этих ферментов требуются только ионы Mg2+ в физиологических концентрациях. Рестриктазы класса 2 обычно узнают последовательности двухцепочечной ДНК длиной от 4 до 8 пн, имеющие ось симметрии второго порядка, — палиндромы.

При этом ряд рестриктаз расщепляет ДНК строго по оси симметрии узнаваемой последовательности, что приводит к образованию фрагментов ДНК с тупыми концами, не имеющими выступающих одноцепочечных участков.

Другой фермент — ЕcoRIузнает гексануклеотидную последовательность и расщепляет ее с образованием взаимокомплементарных одноцепочечных липких концов.

Если гидролизировать молекулы ДНК различного происхождения рестриктазой ЕcoRI, то в каждом случае будет образовываться строго определенный специфический набор фрагментов ДНК. Важно подчеркнуть, что все фрагменты будут иметь идентичные липкие концы. При смешивании разных препаратов таких фрагментов ДНК в определенных условиях липкие концы могут реассоциировать за счет комплементарных взаимодействий, и таким образом могут стыковаться фрагменты молекул ДНК, выделенных из любых организмов.

Размер узнаваемой рестриктазой последовательности, как правило, обусловливает частоту встречаемости этих участков в природных ДНК. Для случайной последовательности ДНК бесконечной длины с равным содержанием каждого из четырёх нуклеотидов вероятность наличия определенной последовательности длиной N на молекуле ДНК будет равна, причем вырожденность последовательности участков узнавания, обнаруженная для некоторых рестриктаз, увеличивает данную вероятность.

Большой интерес для экспериментов по клонированию фрагментов ДНК представляют рестриктазы, которые, обладая разной специфичностью, дают при гидролизе ДНК одинаковые липкие концы. После соединения одинаковых липких концов, возникающих при действии на ДНК различных рестриктаз, обычно образуются гибридные последовательности, уже не узнаваемые некоторыми из этих ферментов.

Целенаправленный поиск эндонуклеаз рестрикции класса 2, обусловленный значением этих ферментов, привел к открытию большого числа новых рестриктаз. Новой считается любая рестриктаза, найденная в не изученном ранее штамме. Дальнейшие исследования позволяют решить, действительно ли данный фермент узнает новую последовательность нуклеотидов или же является аналогом уже известной рестриктазы. В том случае, если обнаруженная рестриктаза узнает ранее неизвестную последовательность, она называется прототипом. Однако часто ферменты, выделенные из различных микроорганизмов, узнают одну и ту же последовательность и при гидролизе определенной ДНК образуют одинаковый спектр фрагментов.

Такие рестриктазы называются изошизомерами. В то время, узнавая одну и ту же последовательность, рестриктазы могут по-разному расщеплять двухцепочечную ДНК. Поэтому ферменты, имеющие одинаково узнаваемые последовательности и одинаково их расщепляющие, принято называть истинными изошизомерами.

Как уже отмечалось, подавляющее большинство рестриктаз класса 2 используют в качестве субстрата немодифицированную ДНК. Однако выявлены рестриктазы данного класса, которые расщепляют in vitro только метилированные последовательности ДНК.

Рестриктазы класса 3 имеют некоторое сходство с рестриктазами класса 1. Нативный фермент состоит из двух различных субъединиц и бифункционален, т. е. обладает как рестриктазной, так и иетилазной активностью.

Рестриктазы класса 3 узнают несимметричные последовательности длиной 5−6 пн и расщепляют ДНК в стороне от участков узнавания на расстоянии 24−27 пн, образуя одноцепочечные — концы длиной 2−3 нуклеотида. Для проявления эндонуклеазной активности требуется только АТР и ионы Mg2+, а SAM лишь стимулирует реакцию, причем расщепление ДНК не сопровождается гидролизом АТР. При действии ферментов данного класса in vitro не удается исчерпывающе гидролизировать ДНК. Причины этого пока не известны.

Рестриктазы необычайно широко распространены в мире микроорганизмов. Показано, что рестрикция и модификация не коррелируют с патогенностью. Не обнаружено и зависимости от потребления кислорода, т. е. R-М системы имеются и в аэробах, и в анаэробах. Строение клеточной стенки также не накладывает ограничений на присутствие систем рестрикции-модификации. Необходимо подчеркнуть, что рестриктазы и метилазы не являются обязательными компонентами клетки. Штаммы, не содержащие R-М систем, иногда называют «нулевыми».