Гетерогенное окружение. 
Измерение роста микроорганизмов

Измерение роста микроорганизмов в естественных условиях связано с большими трудностями. Как правило, в природных условиях встречаются смешанные культуры, в которых бактерии прикрепляются друг к другу, к частичкам почвы и листьям. В этих случаях рост измеряют четырьмя основными методами. Первый из них заключается в определении фиксации 14С-двуоки-си углерода растущей биомассой. Второй предусматривает идентификацию клеток с реплицирующейся ДНК, меченной 3Н-тимидином, по радиоавтографии. В третьем методе для идентификации микроорганизмов в образцах почвы применяют флуоресцирующие антитела. Наконец, информацию о росте микроорганизмов можно получить с помощью усовершенствованной масс-спектрометрии газов, выделяемых образцами почвы. Подробное обсуждение этих вопросов не входит в задачи настоящего руководства.

бактериальный сбалансированный несбалансированный мицелиальный.

Рост и размножение микроорганизмов

Сложные процессы метаболизма, происходящие в клетке, отражаются такими явлениями, как рост и размножение микроорганизмов.

Термин «рост» означает увеличение массы клеток микроорганизмов в результате синтеза клеточного материала.

Интенсивность роста микроорганизмов можно определить делением их массы на численность особей в единице объема в отдельные промежутки времени. Рост индивидуальной клетки заканчивается размножением.

Под размножением микробов подразумевают способность их к самовоспроизведению, т. е. увеличению количества особей микробной популяции на единицу объема.

Отдельные группы микроорганизмов размножаются различными способами. У бактерий преобладает деление, может быть почкование. Грибы размножаются при помощи спор, вегетативным способом (участками мицелия), половым путем и почкованием (дрожжи). Вирусы размножаются путем репродукции вирусных частиц внутри клеткихозяина.

Прокариотические клетки размножаются путем прямого (поперечного) деления. В процессе роста в клетках начинает нарастать количество общего азота, РНК и ДНК. Нуклеоид увеличивается в объеме, и в точках прикрепления к цитоплазматической мембране двухцепочечная ДНК под действием ферментов разрывается по водородным связям. Происходят репликация ДНК и синтез комплементарных вторичных цепочек, которые расходятся по полюсам клетки. Они в дальнейшем станут нуклеоидами дочерних клеток.

После деления нуклеоида начинается образование поперечной двухслойной перегородки, которая формируется за счет цитоплазматической мембраны.

Различают изоморфное и гетероморфное деления клеток. При изоморфном делении перегородка формируется на середине клетки, в результате чего образуются две одинаковые по величине клетки. В некоторых случаях деление носит асимметричный характер, при котором дочерняя клетка отделяется от одного из концов бактерии и новые клетки имеют неодинаковую величину. Такое деление называют гетероморфным. Оно может наблюдаться в старых культурах, после обработки микроорганизмов малыми дозами пенициллина, некоторыми химическими веществами, при ультрафиолетовом облучении и воздействии других факторов. В результате такого воздействия происходит нарушение координации между ростом и делением клетки, в результате чего бактерия увеличивается, а деление ее не осуществляется.

Разделившиеся клетки могут отделяться одна от другой или оставаться рядом, формируя диплоили стрептобактерии, стрептококки, стафилококки и сарцины. Это зависит от характера распределения слизистого слоя вокруг разделившейся клетки, от свойств питательной среды и др.

У большинства бактерий делящая перегородка располагается, как правило, перпендикулярно длине, у кокков — в любой плоскости. У спирохет в редких случаях перегородка может располагаться и вдоль клетки.

Бактерии характеризуются высоким темпом размножения, который обусловлен небольшим временем генерации, т. е. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки. Например, время генерации кишечных палочек в оптимальных условиях составляет около 20 мин. Продолжительность периода зависит от вида бактерии, ее возраста, характера среды, условий культивирования и т. п.

Теоретически вычислено, что при делении клетки через каждые 20−30 мин количество бактерий за 24 ч составило бы 10−15 млрд. клеток, а через 5 сут. размножения одна клетка дала бы такую живую массу потомства, которая заполнила бы собой бассейны морей и океанов нашей планеты.

Однако в действительности такого быстрого размножения микробов не происходит, так как в естественных условиях отрицательно влияют на размножение накапливающиеся продукты метаболизма, ультрафиолетовые лучи, низкая и высокая температуры внешней среды и др.

Размножение бактерий в ограниченном объеме жидкой питательной среды (в пробирке, колбе) происходит в определенной закономерности, изображаемой в виде типичной кривой размножения (рис. 1). Эта кривая косвенно характеризует также и отмирание клеток, параллельно идущее с размножением.

На кривой размножения различают четыре основные фазы роста культуры, сменяющие друг друга в определенной последовательности: начальная фаза (лаг-фаза), экспоненциальная, или логарифмическая (логфаза), стационарная фаза и фаза отмирания. Лаг-фаза — период задержки роста микроорганизмов, в течение которого внесенные в питательную среду бактерии адаптируются к новым условиям обитания и начинают размножаться с нарастающей скоростью. В этой фазе размеры клеток в 3−5 раз больше обычных, имеют большую биохимическую и энергетическую активность и повышенную чувствительность к различным бактерицидным факторам. Продолжительность лаг-фазы зависит от видовых особенностей микроорганизмов, количества засеваемого материала, питательных веществ и др. Для молочнокислых бактерий этот период составляет от 1 до 4 ч.

Лаг-фаза характеризуется быстрым и постоянным (через равные промежутки времени) размножением бактерий логарифмическим ростом их популяции, т. е. количество клеток увеличивается в геометрической прогрессии: за время равное одной генерации — в 2 раза, за два срока — в 4 раза, за три генерации — в 8 раз и т. д. В этот период морфологические свойства типичны для данного вида, вся популяция однородна, устойчивость клеток к неблагоприятным факторам возрастает. Продолжительность этой фазы 5−8 ч. Для того чтобы клетки длительное время находились в экспоненциальной фазе роста, микроорганизмы выращивают в так называемой непрерывной культуре.

При этом в сосуд, содержащий популяцию растущих клеток, непрерывно вводят новые порции питательной среды в определенных количествах и одновременно удаляют из него соответствующее количество бактериальной суспензии вместе с продуктами метаболизма.

Непрерывное культивирование осуществляют в специальных сосудах-культиваторах (хемостатах и турбидостатах).

Стационарная фаза завершает период роста культуры и продолжается 4−5 ч. Она характеризуется сбалансированным (уравновешенным) размножением и отмиранием (под действием продуктов обмена) бактерий. Вследствие этого в каждую единицу времени в среде имеется определенное количество живых и столько же мертвых микроорганизмов. При этом кривая роста, достигнув своего максимума, становится параллельной оси абсцисс. В этой стадии наряду с типичными клетками встречаются дегенеративные и инволюционные формы. Эти изменения обусловлены ограничением количества питательного субстрата, большой концентрацией клеток и накоплением токсических продуктов обмена.

Фаза отмирания (старения культуры) характеризуется превосходством количества погибающих бактерий над количеством образующихся. Кривая роста приобретает наклонное положение, она соответствует фазе отмирания микроорганизмов, т. е. гибели с постоянной скоростью через равные промежутки времени.

Причиной отмирания клеток являются истощение питательной среды, накопление ядовитых продуктов обмена, изменение физико-химических свойств среды, автолиз, т. е. лизис клеток под действием собственных ферментов. В этой фазе бактерии изменяют свою морфологию — появляются шаровидные, нитевидные, ветвящиеся и другие формы. У спорообразующих видов наряду с отмиранием вегетативных клеток происходит образование спор. Микроорганизмы могут утрачивать подвижность, способность воспринимать окраску, становятся грамм-вариабельными (изменяют окраску по Граму), утрачивают часть биохимической активности, вирулентности, антигенных свойств и др. Продолжительность фазы у разных видов бактерий неодинакова. Для большинства сапрофитных и молочнокислых бактерий она составляет 2−3 сут. Некоторые виды молочнокислых бактерий погибают через 7−10 дней.

Описанные закономерности развития популяции будут правильными при выращивании ее в оптимальных условиях. Так, если поместить посевы в ледяную воду, культура прекратит рост и кривая роста не только не поднимется вверх, но после некоторой протяженности по горизонтали опустится вниз.

Рост микроорганизмов в жидкой питательной среде может проявляться помутнением и изменением цвета среды, наличием или отсутствием пристеночного кольца и поверхностной пленки различного характера, наличием или отсутствием осадка. При выращивании на обезжиренном молоке молочнокислые бактерии вызывают в первые сутки культивирования свертывание молока с образованием однородного плотного сгустка без обильного выделения молочной сыворотки и газа, с кисломолочными вкусом и запахом.

При размножении на плотных питательных средах микроорганизмы образуют колонии (от nar. colonia — поселение), которые представляют собой видимые скопления особей одного вида и формирующиеся в результате размножения, как правило, одной клетки. Они бывают круглой, розеткообразной, звездчатой, древовидной формы, могут иметь поверхность гладкую, выпуклую, плоскую, куполообразную, вдавленную. Колонии отмечаются также по строению края, который, может быть ровным (S-форма) ишероховатым (R-форма). По величине колонии подразделяют на крупные (свыше 4 мм) в диаметре, средние (2−4 мм), мелкие (1−2 мм) и карликовые (меньше 1мм).Колонии отличаются также по консистенции, плотности, прозрачности, цвету. Они бывают слизистыми, сметанообразными, влажными, сухими, прозрачными, полупрозрачными и непрозрачными, окрашенными и бесцветными. Различные виды микроорганизмов образуют специфические колонии на плотных питательных средах и дают характерный рост на жидких средах. Особенности роста микробов на питательных средах называют культуральными свойствами. Их учитывают при определении видов микроорганизмов.

Под ростом понимают согласованное увеличение количества всех химических компонентов, формирующих клеточные структуры. Рост клеток обычно сопровождается увеличением их массы и размеров. Однако эта закономерность наблюдает всегда, так как в некоторых условиях клетки способны просто накапливать запасные или резервные вещества, т. е. масса может увеличиваться, но роста при этом не наблюдается. В подходящей же среде, к которой бактерии полностью адаптированы, они находятся в состоянии сбалансированного роста. В период сбалансированного роста удвоение биомассы сопровождается удвоением всех других учитываемых параметров популяции, например количества белка, ДНК, РНК и внутриклеточной воды. Иными словами, культуры, растущие сбалансировано, сохраняют постоянный химический состав. В условиях сбалансированного роста легко определить величину скорости роста бактериальной популяции в каждый момент времени, если измерить прирост любого компонента клетки по отношению к его исходному количеству. Таким образом, в культуре, растущей сбалансировано, скорость прироста вещества клеток в любой данный момент пропорциональна числу или массе имеющихся в это время бактерий. Коэффициент пропорциональности называют удельной скоростью роста (м).Данная величина отличается для разных культур, и даже для одной культуры.

После интегрирования и перехода к десятичным логарифмам получим формулу для определения удельной скорости роста (ч-1). Если рост клеток в культуре ограничен количеством внесенного в питательную среду компонента, то между его начальной концентрацией и полученной биомассой клеток существует постоянная линейная зависимость (при условии ограничения роста только по одному параметру). Масса клеток, образованная на единицу использованного компонента среды, представляет собой величину, которую называют экономическим коэффициентом (или выходом биомассы) — Y. Эту величину определяют по уравнению, где Х — масса сухого вещества клеток (г/мл культуры), вступившей в стационарную фазу роста; Х0 — масса сухого вещества клеток в 1 мл среды сразу после инокуляции среды; (Х — Х0) — урожай бактериальной культуры (урожай зависит от количества и природы используемых питательных веществ, а также от условий культивирования); (S0 — S) — количество потребленного субстрата (компонента среды).В лабораторных и промышленных условиях используют два основных способа культивирования микроорганизмов: периодическое (статическое) и непрерывное (проточное).

Рост бактерий в периодической культуре происходит до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов питательной среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов метаболизма, то получается так называемая периодическая культура (популяция клеток в ограниченном жизненном пространстве).Зависимость концентрации жизнеспособных клеток при периодическом культивировании от длительности инкубирования описывается характерной кривой, которая имеет S-образную форму (рис. 2).

На кривой можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности: начальную или лаг-фазу; экспоненциальную, или логарифмическую, фазу; стационарную фазу; фазу отмирания. Лаг-фаза, или фаза задержанного роста, охватывает промежуток времени между инокуляцией бактерий и достижением ими максимальной скорости деления. В клетках бактерий в этот период идут в основном процессы, связанные с приспособлением их к условиям культивирования (составу среды, температуре, рН и т. п.).

Продолжительность фазы определяется следующими факторами.

Начальными условиями культивирования вносимого посевного материала. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от тех, которые были в предшествующей культуре, то для приспособления к новым условиям в клетке должен быть синтезирован набор ферментов, потребность в которых ранее отсутствовала и поэтому они в ней не синтезировались. Этот процесс индуцируется внесением нового субстрата. Если проанализировать химический состав бактериальной клетки в течение лаг-фазы, то можно отметить, что во время нее происходит быстрое увеличение количества РНК (в 8−12 раз).

* Возрастом посевного материала: чем старше культура, которую используют для инокуляции новой питательной среды, тем большее время занимает лаг-фаза, хотя при значительном количестве засеваемого активно делящегося посевного материала культура может развиваться без лаг-фазы. Во время лаг-фазы деления клеток не происходит, отмечаются лишь процессы, подготавливающие клетку к размножению.

Лаг-фаза переходит в начальную фазу размножения, или фазу ускорения роста, когда клетки начинают делиться с постепенно увеличивающейся скоростью. Фаза экспоненциального (логарифмического) роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и скоростью роста. Для различных видов бактерий эти величины могут варьировать в значительных пределах. Например, бактерии E. coli при 37єС делятся примерно каждые 20 мин, а бактерии родов Nitrosomonas и Nitrobacter -5−10 ч. Культуры бактерии E. coli вступают в стационарную фазу при концентрации клеток 2−5 109/мл. Во время экспонециальной фазы все клетки в популяции имеют приблизительно одинаковый размер, содержат максимальное количество РНК, количество белка в них также максимально и постоянно. Во время экспоненциальной фазы клетки наиболее жизнеспособны и обладают высокой биохимической активностью. Стационарная фаза наступает тогда, когда число жизнеспособных клеток достигает максимума и не увеличивается, так как скорость размножения бактерий равна скорости их отмирания. В связи с тем, что скорость роста определяется концентрацией субстрата, то еще до его полного использования начинает снижаться и скорость роста, поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может снижаться не только из-за недостатка субстрата, но и вследствие высокой плотности бактериальной популяции, при низком парциальном давлении кислорода или по причине накопления токсичных продуктов обмена. Все эти факторы обусловливают переход к стационарной фазе. Переход в стационарную фазу включает период несбалансированного роста, когда компоненты клеток синтезируются с различными скоростями, соответственно и содержание отдельных химических веществ в клетках на разных стадиях отличается.

Химический состав клеток зависит от фактора, лимитирующего рост.

Клетки в стационарной фазе меньше по размеру, содержат меньше РНК, более устойчивы к различного рода воздействиям (физическим и химическим), чем в экспоненциальной фазе роста культур. В этот период в клетках или в среде культивирования нередко накапливаются продукты вторичного метаболизма (антибиотики, пигменты, бактериоцины и др.).

Продолжительность этой фазы может быть от нескольких часов до нескольких дней в зависимости от вида микроорганизма. В стационарную фазу роста поведение клеток в бактериальной популяции может регулировать явление, которое получило название апоптоз. Суть его сводится к тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция бактерий разделяется на две субпопуляции, одна из которых погибает и подвергается автолизу, клетки же другой популяции, используя продукты автолиза как субстрат, продолжают размножаться. Установлен механизм генетического контроля апоптоза у бактерий E. coli. Он осуществляется особым опероном maz, представленным двумя генами: maz E и maz F. Продукт гена maz F — стабильный цито-токсический белок-киллер, а продукт гена maz E — нестабильный белок Мaz E, разрушающий белок-киллер. Истощение фонда аминокислот в питательной среде приводит к блокированию экспрессии оперона maz, в результате синтез белка Мaz E прекращается и белок-киллер вызывает гибель и автолиз части популяции. В среде пополняется фонд аминокислот, синтез белка Мaz E у оставшихся живых клеток активируется, и они продолжают размножаться. В фазе отмирания происходит экспоненциальное снижение числа живых клеток. Скорость отмирания бактерий существенно варьирует в зависимости от условий среды и физиологических особенностей организма. Например, энтеробактерии отмирают медленно в отличие от некоторых видов бактерий рода Bacillus, скорость гибели которых проис-ходит быстро. Причины отмирания клеток могут быть разными. Это и накопление органических кислот (как у бактерий родов Escherichia, Lactobacillus), автолиз (лизис над действием собственных ферментов), накопление антибиотиков, бактериоцинов и др. В условиях непрерывного (проточного) культивирования в сосуд, содержащий популяцию бактерий, подается свежая питательная среда и из него одновременно удаляется часть среды с клетками микроорганизмов. Это позволяет на длительное время задержать культуру в состоянии экспоненциального роста.

Проточное культивирование осуществляется в аппаратах (ферментерах) двух типов: хемостатах и турбидостатах. Хемостат состоит из сосуда-культиватора, в который с заданной постоянной скоростью поступает питательная среда. Для равномерного и полного смешения питательных веществ содержимое культиватора механически перемешивается и аэрируется стерильным воздухом. Избыточная биомасса клеток с питательной средой вытекает из культиватора через сливной сифон. В хемостате прирост биомассы прямо пропорционален скорости притока субстрата и удаления продуктов метаболизма. Примером хемостата в природе служит рубец жвачных животных. Турбидостат представляет собой ферментер, в котором поддерживается заданная плотность клеток за счет определения оптической плотности среды культивирования. Когда количество биомассы увеличивается относительно некоторого выбранного уровня, что фиксируется фотоэлементом, соединенным с системой реле, включается подача свежей питательной среды.

Для глубинного культивирования бактерий с аэрацией в промышленных и лабораторных условиях применяют биореакторы, или ферментеры. Они представляют собой герметические котлы, в которые заливается жидкая питательная среда. Ферментеры снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальное значение рН и редокс-потенциал, дозированное поступление необходимых питательных веществ. Кроме того, они снабжены системами перемешивания, аэрирования, охлаждения, пеногашения.

Непрерывное культивирование широко используется в промышленной микробиологии, а также при проведении физиологических, биохимических и генетических исследований, так как в данных условиях наблюдается константная плотность популяции и концентрация всех компонентов питательной среды.

Для изучения процессов обмена веществ на протяжении цикла клеточного деления часто необходимо, чтобы все клетки в популяции делились одновременно (синхронно). Культуры, в которых все клетки находятся на одинаковой стадии клеточного цикла и делятся одновременно, называют синхронными. Синхронизировать рост и деление клеток в какой-либо популяции можно различными искусственными приемами, такими как изменение температуры, изменение интенсивности освещения (для фототрофных микроорганизмов), лимитирование количества питательных веществ или фильтрование суспензии клеток микроорганизмов через специальный фильтр, позволяющий отобрать клетки одного размера. Однако в синхронизированном состоянии культура не может находиться длительное время и после двух-трех генераций процесс деления клеток асинхронизируется.

Культивирование иммобилизованных клеток микроорганизмов находит широкое применение в биотехнологии, а именно в производстве ценных органических веществ, в деградации токсичных природных и неприродных соединений, а также промышленных отходов, для очистки сточных вод от загрязнений.

Методы иммобилизации клеток основаны на способности микроорганизмов к адсорбции на твердых поверхностях. Существуют два принципиально различных подхода к иммобилизации: без образования ковалентной связи между клеткой и носителем (физические) и с образованием ковалентной связи между ними (химические).

Химические методы иммобилизации предполагают образование ковалентной связи между какой-либо из функциональных групп на поверхности клетки микроорганизма и материалом носителя. Они методы применяются сравнительно редко, так как клетки в этом состоянии могут терять нужную активность.

Физические методы иммобилизации реализуются в результате адсорбции микроорганизмов на поверхности различных нерастворимых синтетических или природных пористых материалов, при включении клеток в поры поперечно-сшитого геля и т. п. Например, при смешивании суспензии клеток с раствором полимера (полиакриламид, агароза и т. п.) с последующей полимеризацией образуется пространственная структура геля с включенными в его ячейки клетками микроорганизмов. В результате микроорганизмы оказываются заключенными в ячейки, которые ограничивают их перемещение, но не препятствуют поступлению питательных веществ и осуществлению каталитических функций.

В настоящее время разрабатываются методы иммобилизации клеток путем их включения в белковые мембраны с использованием коллагена, казеина, миозина и других белков или полипептидов. Мембраны с иммобилизованными клетками сворачивают в рулон и помещают в колонку, через которую пропускают субстрат.

Иммобилизованные клетки сохраняют высокую ферментативную активность, что позволяет использовать их в непрерывно действующих технологических процессах. При этом облегчается выделение продуктов.