Методы исследования. 
Анализ запасных белков семян сортообразцов галеги восточной

Электрофоретический анализ запасных белков семян галеги восточной проводили на приборе SЕ-250 фирмы GEHealthcare (Англия) в Испытательной лаборатории качества семян УО БГСХА, аккредитованной на соответствие требованиям СТБ ИСО/МЭК 17 025−2007, с использованием методики «Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян» [7]. В качестве стандарта использовали исключительно стабильный спектр семян культурной сои.

Белки из семян для электрофореза экстрагировали трис-HCL буфером, рН 6,8, содержащим глицин, сахарозу в растворе дистиллированной воды. Элетрофорез белков галеги восточной проводили в гелевом носителе, приготовленном по методу Лэммли [8], с использованием 10% разделяющего ПААГ [2, 8].

Идентификация сорта, а также определение степени внутрисортового полиморфизма включали позерновой анализ отдельных семян, взятых из случайной выборки. Для детального анализа биотипного состава сортообразцов, оценки уровня генетического полиморфизма, оценки его чистоты и генетической конституции с большей точностью анализировали 100 семян. Идентификация белковых компонентов электрофоретического спектра позволила получить белковый электрофоретический спектр глобулинов семян галеги восточной. Как правило, электрофореграмма сортообразца включала 25−50 белковых компонентов, имеющих как градацию по подвижности в геле (относительной подвижности), так и различную интенсивность окраски, что обусловлено количеством белка в данном компоненте.

Электрофоретический спектр характеризовался визуально по параметрам относительной подвижности (Rf), т. е. местоположению белкового компонента на дорожке электрофоретического спектра одного семени относительно стартовой позиции и интенсивности окрашивания компонентов (степени выраженности).

Компонент — единица, отраженная в электрофоретическом спектре в качестве белковой полосы, детерминированная кластером генов и представленная множественными аллелями разной интенсивности (слабый, нормальны и сильный). Визуально компонент представлен в виде концентрированных полос, состоящих из молекул полипептида с одинаковым значением молекулярных масс (кДа).

Для точного определения молекулярной массы белковых фракций спектра использовался набор стандартных маркеров с известными массами в диапазоне 14,4−116,0 кДа (производитель -«Sigma-Aldrich»). Для сравнительной оценки сортоообразцов галеги восточной использовалась электрофореграмма белков семян сорта Нестерка.

Оценка молекулярной массы фракций проводилась с использованием построенного калибровочного графика по величинам lgM маркера и величинам Rfоцениваемых компонентов (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка в полулогарифмической системе координат: 1 — сывороточный альбумин; 2 — яичный альбумин; 3 — пепсин; 4 — химотрипсиноген; 5 -миоглобин; 6 -цитохром с; Х-фракция белка с неизвестной молекулярной массой

Идентификация белковых компонентов электрофоретического спектра позволила получить электрофоретический спектр глобулинов зерна многолетних трав. Электрофореграмма сорта включала 25−50 белковых компонентов, имеющих градацию по подвижности в геле, а также различную интенсивность окраски, что обусловлено количеством белка в данном компоненте.

Электрофоретический спектр характеризовался визуально по параметрам относительной подвижности (местоположение белкового компонента относительно стартовой позиции — кармана гелевой пластины) и степени интенсивности компонентов от 10 до 120 позиций с градацией на зоны спектра.

Для оптимизации процедуры идентификации отдельных компонентов спектра использована оценка с учетом необходимости регистрации полипептидов с молекулярными массами от 15 до 80 кДа. Для определения масштаба шкалы использовали набор стандартных метчиков молекулярных масс, производимых компанией Sigma — БСА (65 кДа), для позиции 22, яичный альбумин (45 кДа) — 37, химотрипсиноген (25 кДа) — 65 и миоглобин (17,5 кДа) — для 108 позиции белкового спектра.

Именно эти позиции могут быть использованы в качестве реперных для отсчета и идентификации остальных компонентов белкового спектра.

Стандартом служил стабильный спектр семян культурной сои.

• 1. Для составления сортовых формул использовалитабличный вариант. При написании белковых формул использовали цифровую оценку интенсивности полипептидов: с — очень слабый (следы), 1 — слабый, 2 — интенсивный, 3 — очень интенсивный, 4 — сдвоенный. В сортовую формулу вносились номера тех компонентов, которые имелись в спектре глобулина определенного сортообразца. Сортовыми признаками являлись распространение компонентов по позициям (относительная подвижность) и их степень интенсивности (доза гена).
• 2. Полученные электрофоретические спектры индивидуальных семян разделяли на группы, имеющие одинаковый компонентный состав, т. е. на биотипы. К одному и тому же биотипу относили спектры с идентичным компонентным составом (как по подвижности, так и по степени интенсивности), а также спектры, незначительно отличающиеся по интенсивности отдельных компонентов.
• 3. Если сортообразец был полиморфным, т. е. имел несколько типов спектра, то для каждого типа определялась частота встречаемости в анализируемом образце в расчете на стандартную выборку (рис. 2).

Рис. 2. Характер внутрии межсортового полиморфизма, выявленный по запасным белкам семян галеги-восточной (представлены суммарные спектры выборки семян на основе ПААГ геля)

Примечание: 1,2,3,4 -биотипы образца СЭГ-1; 5,6,7,8, 9 -биотипы образца СЭГ-2; 10,11,12,13,14 -биотипы образца БГСХА-2; 15, 16 -биотипы образца КВТ; 17,18, 19 -биотипы образца БГСХА-КБ; Stбелок из семян культурной сои Проведенный анализ семян галеги в ПААГ-геле показал, что все полипептиды распределены в диапазоне от 14 до 116 кДа. Полипептидные спектры состояли, как правило, из 32−38 компонентов. Спектры белков для удобства были условно разделены на восемь зон. Оценка степени полиморфности сортовых популяций проводилась на основе III, V, VII зон белкового спектра.

Было установлено, что в зоне I (66−110 кДа) у всех сортообразцов четко проявлялся один интенсивно окрашенный и 2−3 компонента средней и слабой интенсивности. Наибольшей изменчивостью обладали легко подвижные компоненты в области от 45 до 65 кДа (зона II), в которой у разных образцов присутствовало от 3 до 5 компонентов. В зоне III (35−40 кДа) выявлено 3−4 ярко выраженных компонента и от 2 до 5 слабоокрашенных. Самыми обедненными по компонентному составу и интенсивности их окрашивания были V, VI, VIIзоны спектра, содержащие белковые фракции с массой 30−31, 28−29 и 25−26 кДа. Вместе с тем именно по этим фракциям нами выявлены наиболее вариабельные компонентные позиции, большая часть из которых является сортоспецифичной. Зоны VII, VIII содержали компоненты с молекулярной массой в диапазоне 19−23 и 14−17 кДа и были представлены в основном белковыми фракциями с сильной и средней степенью выраженности.

В результате анализа спектров электрофореграммы на сортоспецифичность было установлено, что между сортообразцами существуют различия по компонентному составу белка в зависимости от их генотипа. Различия полипептидного состава наблюдались в сортообразце СЭГ-1 (зона III), где отмечено отсутствие полосы 41 кДа и увеличение содержания полос 44, 39 кДа. В сортообразце СЭГ-2 (зона II), в отличие от других исследуемых сортообразцов, имеется дуплет из полипептидов 45, 43 кДа, которых практически нет в других образцах данной электрофореграммы.

Отличительной особенностью электрофореграммы белков семян сортообразцов БГСХА-2, КВ-Т и БГСХА-КБ было появление новой минорной полосы 73 кДа (зона I). У сортообразцов КВ-Т и БГСХА-КБ отмечено также увеличенное содержание полипептидов 25, 30, 32 кДа. Все это подтверждает наличие у сортообразцов межсортовых различий на генетическом уровне. Созданные образцы отличались по генотипу и от стандартного сорта Нестерка.

Внутрисортовой полиморфизм сортообразцов галеги восточной изучался по разнообразию биотипов и различиям в спектрах компонентов белка. Было установлено, что наибольшим разнообразием биотипов характеризовались сортообразцы СЭГ-2 и БГСХА-2, имеющие в структуре сорта по 5 биотипов. Наименее полиморфным был сортообразец КВ-Т, включающий только 2 биотипа. Сортообразцы БГСХА-КБ, как и стандартный сорт Нестерка, состояли из 3-х, а СЭГ-1 — из 4-х биотипов. Данные сортообразцы были отнесены к группе среднеполиморфных.

По спектрам компонентов белка различия между биотипами в большей степени проявились в зонах I (66−110 кДа) и IV (30−31 кДА). Так, у биотипа № 3 сортообразца СЭГ-1 в отличие от других отсутствует ярко выраженная полоса 72 кДа, но присутствуют полосы 30 и 31 кДа. У сортообразца БГСХА-2 биотип № 10 отличался от всех других биотипов наличием ярко выраженных полос 27 и 28 кДа. Биотипы сортообразца КВ-Т различались между собой по количеству интенсивно окрашенных компонентов, которых было значительно больше у биотипа № 16, чем у биотипа № 15. У сортообразца БГСХА-КБ наибольшие различия между биотипами № 17, 18 и 19 отмечены по полосам 24, 23 и 22 кДа.

Анализ спектров электрофореграммы сортообразцов галеги восточной СЭГ-1,СЭГ-2, БГСХА-2, КВ-Т и БГСХА-КБ показал, что они различаются между собой по компонентному составу белка. У сортообразца СЭГ-1 различия выявлены в полипептидном составе (зона III), характеризующиеся отсутствием полосы 41 кДа и увеличением содержания полос 44, 39 кДа. Сортообразец СЭГ-2 (зона II) отличается от других сортообразцов дуплетом из полипептидов 45, 43 кДа. Отличительной особенностью сортообразцов БГСХА-2, КВ-Т и БГСХА-КБ является появление у них новой минорной полосы 73 кДа (зона I). Наряду с этим у сортообразцов КВ-Т и БГСХА-КБ отмечено увеличенное содержание полипептидов 25, 30, 32 кДа. Все это является подтверждением того, что сортообразцы галеги восточной СЭГ-1,СЭГ-2, БГСХА-2, КВ-Т, БГСХА-КБ, созданные на кафедре селекции и генетики УО БГСХА, различаются между собой на генетическом уровне и отличаются от сорта стандарта.

На основании анализа структуры биотипного состава и особенностей в спектрах компонентов белка установлено, что изучаемые сортообразцы характеризуются внутрисортовой изменчивостью. Наибольшим внутрисортовым полиморфизмом характеризовались сортообразцы СЭГ-2 и БГСХА-2, имеющие в структуре сорта 5 биотипов. Наименее полиморфным был сортообразец КВТ с двумя биотипами. Средней полиморфностью характеризовались сортообразцы БГСХА-КБ (3 биотипа) и СЭГ-1 (4 биотипа). Различия между биотипами одного и того же сортообразца в большей степени проявились по интенсивности окрашивания компонентов белка. Наибольшая изменчивость по степени выраженности компонентов белка в биотипах отмечена в зонах I (66−110 кДа) и IV (30−31 кДА).

Наличие генетических различий между изучаемыми сортообразцами представляет практическую ценность для дальнейшей селекции галеги восточной. Метод электрофоретического анализа белков семян можно эффективно использовать в селекционном процессе для выделения необходимых генотипов как на сортовом, так и внутрисортовом уровнях.