Объектом исследования послужили 22 современных отечественных сорта риса селекции ВНИИриса. Образцы ДНК выделяли из свежесрезанной части листовой пластинки: растений, а также из 10−15 дневных проростков. Экстракцию ДНК проводили буфером следующего состава: 20мл 1 М Tris-HCl (pH 7.5), 5 мл 5MNaCl, 5 мл 0.5MEDTA (pH 8.0), 5 мл 10% SDS в общем объеме 100 мл. Часть листа (2−3см) растирали в 500 мкл экстрагирующего буфера в пластиковой пробирке объемом 1,5мл. Инкубировали образцы при 600С в течение 3 часов. Отделяли супернатант центрифугированием при 12 000 об/мин. К перенесенной в чистую пробирку верхней фазе добавляли 500 мкл изопропанола, оставляли для преципитации на 10−20 минут при комнатной температуре, предварительно перемешав. После этого образец центрифугировали 5 минут при 12 000 об/мин, полученный осадок промывали 300мкл 70% этанола, высушивали и растворяли в 200мкл 0,1*ТЕ. В ПЦР смесь добавляли по 2,5 мкл раствора ДНК, выделенного данным методом. ПЦР проводили по стандартным методикам, но с выполнением предварительной оптимизации ряда параметров реакции [11, 12]. Генотипирование проводили с использованием 14 SSR-маркеров: RM1, RM11, RM122, RM168, RM167, RM164, RM510, RM307, RM154, RM162, RM44, RM316, RM19, RM474. Нуклеотидная последовательность праймеров доступна на сайте www.gramene.org. Маркеры были распределены в мультиплексные наборы по 3−4 маркера.
Предварительную оценку продуктов ПЦР проводили электрофорезом в 2% агарозном геле 30−50 минут при напряжении 150V. В качестве красителя использовали бромистый этидий; гелевые пластины визуализировали в ультрафиолете. Анализ размеров амплифицированных фрагментов SSR — маркеров проводили на автоматическом генетическом анализаторе ABIprism 3130. Обработку данных осуществляли в программе GeneMapper 4.1. Для подсчета показателя «количество эффективных аллелей» и коэффициента Шеннона, характеризующего уровень информативности маркеров, использовали программу GenAlEx 6.5 [13], дендрограмму построили в программе PAST. Фрагментный анализ SSR-маркеров был выполнен на оборудовании ЦКП «Геномные и постгеномные технологии» ФГБНУ СКЗНИИСиВ.
