Результаты исследований. 
Рекомбинантные белки в изучении африканской чумы свиней

Конструирование продуцентов рекомбинантных белков р30 и р72 вируса АЧС

Конструирование рекомбинантной плазмиды рTT9/ASFVр30 с геном белка р30 вируса АЧС подробно описано в работе Копытова В. О. [5]. Для повышения уровня экспрессии рекомбинантного белка р30 ДНК указанной плазмиды трансформировали компетентные клетки E.coli штамма BL21(DE3)pLysS (Promega) [3]. Клетки этого штамма обладают свойством в присутствии индуктора (IPTG) преимущественно экспрессировать рекомбинантные белки и в минимальном количестве собственные белки.

Продуцент рекомбинантного р72 был получен посредством направленного клонирования ПЦР-продукта гена B646L, кодирующего белок р72 вируса АЧС штамма Magadi в плазмиде pET23b+ (Novagen) [3]. Затем плазмидой полученного рекомбинантного клона трансформировали компетентные клетки E.coli штамма BL21(DE3)pLysS.

Экспрессию рекомбинантных белков осуществляли в среде SOB, рН 7,5−8,0 с добавлением 100 мкг/мл ампициллина, 20 мМ MgCl₂ и 1,0 мМ IPTG. Для наращивания бактериальной культуры клона 11, экспрессирующего р30, в питательную среду вносили дополнительно 50 мкг/мл канамицина. Индукцию проводили в течение 4 часов при температуре 28,0±0,5 єС (для клона 11) и при температуре 33,0±0,5 єС (для клона 2/12).

Постановка непрямого ТФ ИФА на основе рекомбинантных белков р30 и р72

При подборе основных параметров сенсибилизации планшет было экспериментально установлено, что оптимальным условием сорбции рекомбинантного белка р30 является сенсибилизация на ЗФР с pH 7,0−7,2 в течение 2 часов при температуре 37 °C или в течение 15 часов при 4 °C в дозе 100−150 нг на лунку, а рекомбинантного белка р72 — сенсибилизация на ФБР с 2 М мочевины с pH 8,0 в течение 4 часов при температуре 37 °C или в течение 15 часов при 4 °C, в дозе 250−300 нг на лунку. При сенсибилизации планшет смесью р30 и р72 использовали оптимально подобранное соотношение 1:1 (по 150 нг каждого белка на лунку). Специфический культуральный антиген АЧС сенсибилизировали на ЗФР с pH 7,0−7,2 в течение 15 часов при 4 °C в дозе 750 нг на лунку.

С целью определения чувствительности метода непрямого ТФ ИФА на основе рекомбинантных белков вируса АЧС для выявления антител планшеты сенсибилизировали различными препаратами антигенов. На подготовленных планшетах проводили титрование специфических к вирусу АЧС и контрольных сывороток.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 — ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИТЕЛ В РЕФЕРЕНС-СЫВОРОТКАХ К ВИРУСУ АЧС МЕТОДОМ НЕПРЯМОГО ТФ ИФА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ АНТИГЕНОВ

Таким образом, испытания рекомбинантных белков р30 и р72 в качестве диагностических антигенов показали их специфичность при выявлении антител в референс-сыворотках крови свиней к вирусу АЧС I, II, III, IV серотипов.

Для изучения начальных этапов процесса антителообразования у свиней, инфицированных высоковирулентными изолятами вируса АЧС, проводили парентеральное заражение подсвинков в дозе 1000 ГАЕ_50/на голову. Затем отбирали кровь на 5−10 сутки после заражения и селезенку от павших животных и исследовали наличие антител к белкам р72 и р30 вируса АЧС методом непрямого ТФ ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2 — ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИТЕЛ В ПРОБАХ КРОВИ И СЕЛЕЗЕНКИ СВИНЕЙ, ЗАРАЖЕННЫХ ВИРУСОМ АЧС ВЫСОКОВИРУЛЕНТНЫХ ИЗОЛЯТОВ, МЕТОДОМ НЕПРЯМОГО ТФ ИФА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ

Как видно из данных таблицы 2, использование смеси рекомбинантных белков р30 и р72 позволяет установить наличие антител при остром течении инфекции уже на 5-е сутки в пробах селезенки и на 7-е сутки в пробах крови. Кроме того, обращает на себя внимание тот факт, что высокий уровень антител в селезенке характерен для начальной стадии инфекционного процесса 5−7-е сутки (пробы Ростов 02/09 и Эльбрус 01/08), когда уровень антигена в селезенке достигает значений титра — 1:40—1:80. На более поздних стадиях инфекционного процесса, т. е. на 10-е сутки начинает возрастать уровень антител в крови, при снижении такового в селезенке (пробы Армения 2007), а титры антигена в крови невысоки — 1:10—1:20. В отличие от проб крови, в пробах селезенки определяются высокие титры антител -1:80 даже при наличии аналогичных значений (1:80) титров антигена (пробы Чечня 11/07 и Эльбрус 01/08). Следовательно, одномоментное присутствие антител и антигена вируса АЧС в крови ведет либо к связыванию данных компонентов в комплексы, либо к их маскированию и получению заниженных значений их титров.

Для изучения начальных этапов процесса антителообразования у животных с хроническим течением болезни использовали сыворотки крови свиней, зараженных низковирулентным штаммом вируса АЧС, любезно предоставленные сотрудниками лаборатории Диагностики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии и проверенные совместно с Беляниным С. А. Исследовали наличие антител к белкам р72 и р30 вируса АЧС методом непрямого ТФ ИФА. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3 — ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ СВИНЕЙ, ЗАРАЖЕННЫХ НИЗКОВИРУЛЕНТНЫМ ВИРУСОМ АЧС, МЕТОДОМ НЕПРЯМОГО ТФ ИФА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ АНТИГЕНОВ

Из данных, приведенных в таблице 3, следует, что использование рекомбинантного р30 и смеси его с рекомбинантным р72 увеличивало чувствительность реакции в 4−8 раз по сравнению с рекомбинантным р72 отдельно и по сравнению с использованием специфического культурального антигена.

Следовательно, для анализа сывороток на наличие специфических антител к вирусу АЧС использование смеси рекомбинантных белков р30 и р72 позволяет повысить чувствительность и специфичность метода непрямого ТФ ИФА. Кроме того, следует отметить, что при низких разведениях исследуемых сывороток (в пределах 1:10 -1:40) показатели оптической плотности при длине волны 405 нм (ОП ₄₀₅) не превышали 0,1, в то время как использованный специфический антиген давал аналогичные показатели только при разведении анализируемых сывороток в 50 и более раз.