Общая характеристика РАБОТЫ

Актуальность работы

Одной из самых актуальных проблем сoвpеменнoй мeдицины является охрана здоровья человека, для решения которой разработаны и утверждены соответствующие концепции и программы, целью кoторых является сохранение и восстановление здоровья. Разработка новейших корригирующих технологий, направленных на сохранение и восстановление функциональных резервов организма человека, восстановление его оптимальной работоспособности является основной стратегией современной восстановительной медицины (Разумов А.Н., Бобровницкий И. П. 2002,2003; Косорлукова Т. В., 2005). Для дальнейшего развития клеточного направления восстановительной медицины чрезвычайно актуален вопрос подготовки достаточного количества эффективного и безопасного клеточного материала для обеспечения трансплантаций и повышения регуляторных, компенсаторных и адаптивных возможностей организма.

После появления первых публикаций об успешном проведении трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в конце 80-х гг. XX века, начали свое развитие первые банки пуповиной крови (Gluckman E., 1989). Пуповинная кровь, представленная для использования некоммерческими государственными и коммерческими криобанками, в настоящее время является альтернативным источником гемопоэтических стволовых клеток, применяемых для трансплантации у детей и взрослых при ряде злокачественных заболеваний, синдромах недостаточности костного мозга, гемоглобинопатиях и некоторых генетических метаболических расстройствах (Gluckman E., 2006, 2010; Rocha V., 2006). Банкирование пуповинной крови — это совокупность процессов сбора, обработки, тестирований и криохранения биоматериала. За прошедшее десятилетие во всем мире увеличилась роль криохранения пуповинной крови и ее применения для трансплантации. Мировая ассоциация доноров костного мозга (World Marrow Donor Association — WMDA) собирает информацию о числе заготовленных единиц банками пуповинной крови по всему миру начиная с 1999 года. На 2008 год WMDA сообщает о деятельности 112 банков пуповинной крови, которыми заготовлено более 450 тыс. единиц пуповинной крови. пуповинный кровь восстановительный медицина В настоящее время в Европе существует 18 банков пуповинной крови, которые получили аккредитацию в NetCord-FACT и еще 40 находятся на стадии регистрации (Navarrete C., 2009). Сегодня пуповинная кровь является признанной альтернативой костного мозга как источника гемопоэтических стволовых клеток, используемых для трансплантации в восстановительной медицине. На настоящий момент в мире выполнено более 10 000 трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток с использованием пуповинной крови (Majhail N.S., 2006). По данным Gluckman T., Rocha V. начиная с 2006 года около 20% трансплантаций стволовых клеток, проводимых в Европе пациентам в возрасте до 20 лет, являются трансплантациями пуповинной крови (http://www.worldmarrow.org/). Это говорит о том, что пуповинная кровь является ценным клеточным ресурсом для тех пациентов, которым не был найден совместимый донор костного мозга, особенно это важно для групп этнических меньшинств. Другим важным преимуществом пуповинной крови является более короткое время необходимое для поиска подходящего донорского материала в сочетании с дешевизной получения такого материала и его легкой доступностью, что особенно это важно для тех пациентов, которые нуждаются в проведении трансплантации в течение 3-х месяцев после проведения поиска донора. Вышеперечисленные преимущества являются предпосылкой для увеличения количества трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. (Wagner J. E., 1992; Harris D. T., 1996; Kogler G., 1996; Ikuta К., 1998; Rubinstein P., 1999; Gluckman E., 2005, Querol S., 2009). Увеличение доступного пула единиц пуповинной крови улучшает вероятность обнаружения донорского материала с оптимальным абсолютным количеством ядросодержащих клеток на кг веса реципиента и минимальным количеством HLA-несовпадений.

Успех трансплантации во многом зависит от достаточного количества гемопоэтических стволовых клеток, поэтому важным вопросом применения пуповинной крови в клинической практике является оценка качества трансплантата, в основе которой лежит определение количества и жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток, содержащихся в трансплантационном материале (Bender J.G., 1994; Gonzalez B.E., 1997; Traineau R., 1998; Allan D.S., 2002; Cotta S.V. et al., 2002; Marino M.P. et al., 2002). Популяционные исследования полиморфизма генов главного комплекса гистосовместимости, проведенные у больных гемобластозами, свидетельствуют об ассоциативной связи системы HLA с острым лейкозом, как у взрослых, так и у детей. (Dorak M.T. 1992,1996,1999; Tayler G.M. 2002, 2008, 2009; Тананов А. Т. 1982; Хамаганова Е. Г., 1989; Зарецкая Ю. М., 2000, Рий А. А., 2007). Имеются данные, полученные отечественными авторами, которые показали повышение частоты встречаемости антигенов В17 и В40, а также снижение частоты встречаемости антигена DR7 у больных детей с острым лимфобластным лейкозом (Тимонова Л.А., Румянцев А.Г.1989). Практически отсутствуют современные данные изучения HLA системы при острых лейкозах у детей. Изучение и разработка высокотехнологичных методов банкирования пуповинной крови и определение стратегии HLAтипирования представляются актуальной задачей, так как позволяют расширить возможности для восстановления функциональных резервов организма у большого количества пациентов, к которым неприменимы стандартные протоколы диагностики и лечения.

Таким образом в связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилась разработка научно-организационного алгоритма и внедрение системного подхода к банкированию пуповинной крови с применением высокотехнологичных и молекулярно-генетических методик работы для трансплантаций в восстановительной медицине.

Задачи исследования:

• 1. Разработать научно-обоснованный алгоритм банкирования пуповинной крови для трансплантаций в восстановительной медицине.
• 2. Внедрить системный подход к банкированию пуповинной крови с использованием высокотехнологичных и молекулярно-генетических методик.
• 3. Исследовать совокупность факторов, влияющих на состав и эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, антеи интранатальных особенностей течения беременности, родов, антропометрических данных, пола новорожденного, срока гестации, различных состояний острой и хронической гипоксии плода.
• 4. Проанализировать клеточный состав пуповинной крови, иммунологическую характеристику, уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов пуповинной крови, общее количество, жизнеспособность и эффективность клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц гемопоэтических стволовых клеток.
• 5. Оценить влияние технологий обработки пуповинной крови на качество и эффективность выделения мононуклеарной фракции пуповинной крови.
• 6. Оптимизировать алгоритм использования различных молекулярно-генетических методик HLA-типирования при банкировании пуповинной крови.
• 7. Исследовать генетический полиморфизм антигенов гистосовместимости у здорового населения московского региона.
• 8. Исследовать характер распределения специфических генов HLA-системы класса I и II при различных вариантах лейкозов у детей и выявить HLA-маркеры предрасположенности / устойчивости к ним.
• 9. Разработать рекомендации системного подхода к банкированию пуповинной крови при неродственных трансплантациях и для восстановления функциональных резервов организма.

Научная новизна

Впервые на большом количестве материала пуповинной крови определена совокупность антеи интранатальных факторов, оказывающих влияние на состав и эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток.

Впервые показано, что результаты автоматического гематологического анализатора и светооптической микроскопии независимы друг от друга и взаимно дополняют референтные значения клеточного состава пуповинной крови. Полученны данные уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов в пуповинной крови, общего количества, жизнеспособности и эффективности клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц в конечном клеточном продукте, которые характеризуют эффективность материала для неродственной трансплантации и восстановления функциональных резервов организма.

Впервые в России оптимизированы процессы проведения исследований и оценки результатов HLA-типирования большого количества образцов пуповинной крови здоровых новорожденных и периферической крови при различных заболеваниях, представленные двумя молекулярными высокотехнологическими методами, такими как SSO на автоматическом процессоре и SSP, позволяющие получать достоверную и однозначную информацию.

Впервые на большом количестве материала изучен характер распределения HLA специфичностей класса I и II у здорового населения московского региона и установлен профиль генов HLA системы соответствующий европеоидам.

Впервые получены данные об особенностях распределения специфических аллелей генов HLA системы при лейкозах у детей и охарактеризованы дополнительные общие маркеры предрасположенности /устойчивости к их развитию.

Впервые разработан и внедрен научно-организационный алгоритм банкирования пуповинной крови, позволяющий обосновано применять высокотехнологичные методы сбора, оценки, тестирования, криохранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. Системный подход к банкированию позволил оптимизировать процесс стандартным условиям работы банков стволовых клеток и получать эффективный материал для неродственных трансплантаций, применение которого при различных заболеваниях повысит саморегуляторные, компенсаторные и адаптивные механизмы возможности организма.

Практическая значимость работы

Практическое значение работы заключается в том, что показана необходимость совместного использования методов автоматического подсчета клеток и светооптической микроскопии, взаимно дополняющих референтные значения клеточного состава пуповинной крови. Определение уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов в пуповинной крови, общего количества, жизнеспособности и эффективности клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц в конечном клеточном продукте характеризует качество трансплантационного материала. Внедренный научно-организационный алгоритм позволяет обосновано применять оптимизированные высокотехнологичные методы банкирования пуповиной крови и получать эффективный клеточный материал для дальнейшего развития клеточного направления восстановительной медицины.

В результате выполненной работы предложена стратегия совместного использования методов HLA типирования большого количества образцов пуповинной крови (с применением технологий SSO и SSP), которая может быть применена в медицинских учреждениях аналогичного профиля в России. Охарактеризованный впервые профиль распределения генов главного комплекса гистосовместимости у здорового населения московского региона может быть использован в качестве группы сравнения в области изучения «HLA и болезни» и в популяционных исследованиях.

Основные положения, выносимые на защиту

Изучение совокупности антеи интранатальных факторов, особенностей течения беременности, родов, антропометрических данные, пола новорожденного и срока гестации, различных состояний острой и хронической гипоксии плода позволяет оценить их влияние на состав и эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для трансплантаций и восстановления функциональных резервов организма.

Эффективность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови характеризует количественный и качественный клеточный состав пуповинной крови, определенный с применением автоматического гематологического анализатора и светооптической микроскопии. Также эффективность конечного клеточного продукта пуповинной крови для трансплантаций и восстановления функциональных резервов организма характеризует уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов в пуповинной крови, общее количество, жизнеспособность, эффективность клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц.

Стратегия применения методов HLA-типирования образцов пуповинной крови, представленная двумя технологиями, такими как SSO и SSP, позволяет проводить быструю обработку большого количества биоматериала и получать достоверные и однозначные результаты.

Исследование полиморфизма генов HLA-системы позволило изучить характер распределения аллельных специфичностей среди здорового населения московской популяции.

Изучение иммуногенетических особенностей при лейкозах у детей позволяет обнаружить маркеры, определяющие риск или устойчивость к возникновению заболевания.

Комплекс усовершенствованных высокотехнологичных методов сбора, оценки, тестирования, хранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, в том числе и типирования образцов по локусам HLA системы, является оптимальным, позволяющим получать однозначную и достоверную информацию и требующим для исследования минимального количества исследуемого биоматериала.

Внедренный научно-организационный алгоритм банкирования пуповинной крови, позволяет получать эффективный материал для повышения саморегуляторных, компенсаторных и адаптивных механизмов организма.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследования внедрены в работу Государственного учреждения здравоохранения города Москвы «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы».

Работа выполнена на базе Государственного учреждения здравоохранения города Москвы «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы», ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» Росздравнадзора РФ, ЦПСиР ДЗ г. Москвы, родильном доме № 10 Управления здравоохранения ЮЗАО г. Москвы, родильном доме № 8 Управления здравоохранения ЮВАО г. Москвы, родильном доме № 17 Управления здравоохранения САО г. Москвы и городской больнице № 8 Управления здравоохранения САО г. Москвы.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях и научных форумах республиканского и международного уровня, в том числе на Российском Съезде гематологов и трансфузиологов (Москва, 2006), Stem cell therapy meeting (Регенсбург, 2007), Всероссийском симпозиуме «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007), Российском медицинском форуме «Проблемы трансплантации пуповинной крови» (Москва, 2007), III Всероссийском симпозиуме «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007), 35 Международном симпозиуме Европейской группы EBMT (Гетеборг, 2010 г.), V международном симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей» (Москва, 2009), XIV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2010 г.), 5 иммуногенетической международной конференции «East-West Immunogenetics Conferece» (Пилсен, 2010 г.), 36 Международном симпозиуме Европейской группы EBMT (Вена, 2010 г.), III научно — практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» (Москва, 2010), 24 Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (European Immunogenetics and Histocompatibility Conference, EFI and 17 the Italian Society for Immunogenetics and Transplantation, AIBT) (Флоренция, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 49 научных работ в периодической печати, как в России, так и за рубежом, в том числе 10 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 268ры.