Комплексный подход к анализу хромосомной организации геномов растений

Результаты нашего исследования показали, что одновременное или последовательное использование нескольких методов выявления на хромосомах молекулярно-цитогенетических маркеров позволяет успешно идентифицировать мелкие хромосомы и более точно локализовать различные ДНК-зонды, а также получать дополнительную информацию о структурной организации митотических хромосом растений.

Наиболее информативным является сочетание различных видов дифференциального окрашивания хромосом и гибридизации in situ с одним или несколькими зондами, проводящиеся на одних и тех же хромосомных пластинках последовательно или одновременно. Такой подход не только позволяет наиболее глубоко исследовать хромосомную организацию генома изучаемого растения, но и легко решать многие конкретные задачи. В частности, именно таким образом была проведена полная идентификация трудно распознаваемых хромосом у Linum flavum L. (Рис. 14).

Рис. 14. Кариотип L. flafum после совмещения различных методов окрашивания хромосом: DAPI (синий) и CMA (зеленый), а также FISH с зондами теломерного повтора (AAATGGG) (красный). 1−14 — хромосомные группы, В — добавочные или В-хромосомы.

Следует отметить, что любое исследование тонкой структуры мелких митотических хромосом с помощью светооптического микроскопа практически невозможно без современных компьютерных технологий. При анализе хромосом небольших размеров и/или малоинформативным рисунком бэндинга особое значение приобретает оптимизация методов получения оцифрованных изображений хромосом и их последующей компьютерной обработки. Новые возможности по улучшению разрешения самых мелких деталей рисунка дифференциального окрашивания хромосом открывают методы деконволюции изображений. Современные методы деконволюции позволяют эффективно устранять размытие изображения (вследствие оптических аберраций и шумов регистрирующей системы) с помощью применения сложного математического аппарата для моделирования процессов формирования изображения и оценки качества восстанавливаемого изображения. В конечном итоге существенно повышается разрешающая способность оптической системы (Рис.15).

Рис. 15. Локализация теломерного повтора (AAATGGG) (красный) на хромосомах льна (L.usitatissimum) методом FISH. Хромосомы окрашены DAPI (синий).

а — метафазная пластинка до деконволюции;

б — та же метафазная пластинка после деконволюции;

в — улучшение качества изображения с помощью деконволюции позволило распознать гомологи и составить кариограмму.

Анализ кариотипов мелкохромосомных растений значительно облегчают специализированные программы хромосомного анализа, работающие в интерактивном режиме. Примером такой программы, созданной фирмой ВидеоТест совместно со специалистами по хромосомному анализу, и в том числе при нашем активном участии, могут служить программы ВидеоТестКарио 1.5 и 2.0 (ВидеоТест, Санкт-Петербург).

Разработка программы ВидеоТестКарио 1.5 была направлена на создание объективного помощника при разностороннем изучении структуры хромосом (Рис. 16). С помощью этой программы анализ изображений хромосом ведется в интерактивном режиме. Взаимодействие исследователя с различными модулями программы позволяет направленно улучшать изображения хромосом, проводить их измерения, определять центромерные индексы, а также положение и размеры бэндов, что особенно ценно при малом числе маркеров хромосом.

Рис. 16. Интерфейс программы хромосомного анализа ВидеоТестКарио 1.5.

Идиограммы строятся в соответствии с интенсивностью окрашивания хромосомы по длине, что позволяет составлять объективные количественные идиограммы. По усредненным данным двух гомологов строится идиограмма хромосом генома изучаемого растения. Полученные результаты измерений хромосом в метафазной пластинке вносятся в таблицу, которая может быть преобразована в формат программы Microsoft Office Excel. Это позволяет накапливать результаты измерений по нужному числу хромосомных пластинок и далее использовать их для математической обработки, что очень важно при изучении полиморфизма хромосом, создании баз данных, а также при проведении сравнительных исследований. Коммерческие специализированные программы хромосомного анализа других производителей не предоставляют такой возможности, что существенно усложняет изучение хромосом разных видов растений.

Особенно эффективно сочетание комплексного подхода к изучению хромосомной организации геномов растений с различными молекулярными методами их исследования. Примерами плодотворности одновременного использования цитогенетических и молекулярных технологий (RAPD, ITS, определение количества ДНК в расчете на 1С) для изучения геномов растений могут служить сравнительные исследования различных видов красных микроводорослей, двухромосомных злаков и льнов, а также сортов и линий гороха, подробно описанные в следующей главе.