Дифференциальное окрашивание хромосом АТ-специфичными флуоресцентными красителями

При проведении FISH для окраски хромосом обычно используют АТ-специфичный флуоресцентный краситель DAPI, выявляющий Q-подобный рисунок окрашивания на хромосомах животных. У растений после гибридизации in situ метафазные хромосомы обычно окрашиваются DAPI монохромно. Как правило, такое окрашивание характерно для растений с крупными геномами (пшеница, ячмень). У растений с небольшими геномами на метафазных хромосомах могут выявляться рисунки DAPI-дифференциального окрашивания. Как показали наши исследования, этот бэндинг становится виден на хромосомах особенно отчетливо после предобработки 9-АМА. Такая предобработка позволила выявить рисунок DAPI-бэндинга не только у льнов (геном льна посевного около 600 млн.п.н.) и цингерии (геном около 1,5 млрд п.н.), но и у гороха (геном около 4,3 млрд п.н.) (См. разделы 2.4 — 2.6).

Рисунок DAPI-дифференциального окрашивания хромосом растений, подобен рисунку С-бэндинга (Рис. 12-I а, б). При этом, чем длиннее хромосомы, тем выше разрешение DAPI-бэндинга (Рис. 12-II, III).

Рис. 12. Изменение рисунка DAPI-окрашивания хромосом L. grandiflorum в зависимости от степени компактизации хромосом:

I — метафаза (а — DAPI-окрашивание и.

б — инвертированное изображение),.

II — прометафаза,.

III — поздняя профаза.

Особенно важно получение высокоразрешающих рисунков DAPI-бэндинга после FISH, поскольку это позволяет не только точно идентифицировать хромосомы, но и отдельные районы хромосом, что существенно повышает точность картирования различных зондов.

Поскольку рисунок DAPI-бэндинга на хромосомах растений не всегда бывает достаточно контрастным, с целью улучшения качества дифференциального окрашивания хромосом при FISH, была изучена возможность применения новых флуоресцентных красителей. Было протестировано 10 димерных бис-бензимидазолов (содержащих две модифицированных группы красителя Hoechst 33 258), синтезированных в ИМБ РАН [Zhuze et al., 2007]. Из них были отобраны четыре соединения: DB(7), DB(8), DB(17) и DB(18), при окрашивании которыми хромосом модельного объекта — человека, выявлялся бэндинг, сходный с рисунками дифференциального окрашивания флуорохромами DAPI или Hoechst 33 258. Контрастность флуорохромного бэндинга, полученного при использовании этих четырех соединений, и его устойчивость к выгоранию была несколько выше, чем в случае DAPI и Hoechst 33 258 .

Рис. 13. Дифференциальное окрашивание хромосом L. grandiflorum флуоресцентными красителями: а — DB (8), б — DAPI, в — Hoechst 33 258, г — красителем Giemsa (С-бэндинг).

При окрашивании этими флуорохромами хромосом льна (L. grandiflorum) выявляется С/DAPI-подобный рисунок дифференциального окрашивания. Бэндинг, полученный при использовании DB(8) и DB(17) имел высокую контрастность и пониженную выгораемость (Рис. 13). Таким образом, полученные результаты открывают перспективы использования новых АТ-специфичных флуорохромов в исследовании хромосом не только человека, но и растений.