Сохранение генофонда растений в культуре in vitro

Сохранение генофонда в культуре in vitro является важным достижением биотехнологии. Этот подход позволяет сохранить и поддержать неограниченно долго генетические коллекции растений без изменения их наследственной основы. Поддержание генколлекций пересевом в различных условиях в течение длительного времени приводит к потере части генотипов и изменению сортовпопуляций. Особый интерес методы in vitro представляют для поддержания уникальных генотипов культурных растений (трансгенных растений, линий с ЦМС, маркированных изогенных линий и др.), а также растений из Красной Книги.

Существуют два подхода для использования методов in vitro в поддержании генколлекций. Первый основан на удлинении пассажа при культивировании растений. В условиях, обеспечивающих медленный рост культур, интервалы между пересадками могут достигать от 12 месяцев до 4 лет. Методики, обеспечивающие медленный рост, основаны на снижении температуры и освещенности, модификации среды, особенно путем добавления осмотиков или ретардантов, дегидратации тканей и модификации газовой среды. Для различных культур используются модификации этих процедур. По данным Р. Г. Бутенко, длительность пассажа можно удлинить до 6−24 месяцев, поместив коллекции в условия низких положительных температур (1−10⁰ С) при интенсивности освещения 4000−5000 лк. При этом выбор температуры зависит от холодостойкости растения. Например для поддержания коллекции картофеля можно использовать температуру 10⁰ С, яблони -1 ⁰ С. Задержать рост растений in vitro можно также добавлением в питательную среду осмотиков (маннита и сорбита), повышением концентрации сахарозы или добавлением в среду ингибиторов роста (гидразид малеиновой кислоты, абсцизовая кислота и др.) В последнее время для задержки роста растений начали использовать снижение атмосферного давления (до 0,04 мм рт. ст) и гипоксию (недостаток кислорода). Гипоксию создают, применяя смесь 90% азота и 10% кислорода (Бутенко, 1990). Располагая на малой площади климокамер большое количество пробирок, можно поддерживать обширные генколлекции. Такой материал удобен для обмена между генбанками. Однако при длительном субкультивировании не исключено возникновение генетических отклонений, а также изменение морфогенетического потенциала.

Более совершенным методом сохранения генколлекций in vitro является криосохранение (замораживание) в жидком азоте при температуре -196 ⁰ С. При такой температуре деление клеток и метаболические процессы останавливаются и растительный материал может сохраняться неограниченный период времени. Хранимый материал не занимает много места, не изменяется генетически и не заражается патогенами Таким способом, можно хранить меристемы и кончики побегов, протопласты, суспензию клеток, зародыши, пыльцу, семена. Глубокое замораживание — хранение — оттаивание является сложной экстремальной процедурой, состоящей из ряда этапов. Поскольку специфика клеток (крупные размеры, сильная вакуолизация, обилие воды) затрудняет замораживание, необходима оптимизация каждого этапа для данного вида клеток, причем особое значение имеет подготовка клеток, подбор криопротекторов — веществ, ослабляющих повреждения от осмотического стресса, а также от механических повреждений при образовании и росте кристаллов льда. Помимо эффективности действия криопротекторы не должны быть токсичными. Наиболее часто используют проникающие в клетки вещества — диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин, а также непроникающие высокомолекулярные вещества — криопротекторы — поливинилпиролидон, декстран, полиэтиленгликоль. Для защиты от поврежений клеток используется их предобработка осмотически активными веществами — маннитом, сорбитом, пролином и др.

Протоколы для хранения растений в жидком азоте разработаны более, чем для 80 видов растений. Существуют два основных подхода к технике замораживания растительного материала. Классический подход (медленное замораживание) основан на дегидратации клеток в процессе снижения температуры (Рис. 6). В этом случае растительный материал замораживают с контролируемой скоростью 0,1−4 ⁰ С /мин до температуры — 40⁰ С с последующим быстрым охлаждением в жидком азоте. К среде, в которой замораживается материал, добавляют криопротекторы. Классическая технология обычно используется для замораживания культуры клеток. Ее применение для апексов и зародышей затруднено. Недостатком метода является дорогое оборудование для замораживания.

растение селекция гаплоид мутаген.

Рис. 5. Выживаемость клеток при быстром и медленном охлаждении (Фаррант, 1980).

Второй подход, разработанный за последние годы — быстрое замораживание. Метод основан на предподготовке растительного материала с последующим его погружением в жидкий азот. Предподготовка имеет целью предотвращение образования межклеточного льда, повреждающего клетки. Эта техника не требует программируемого замораживания, что удешевляет оборудование. Кроме того, растительный материал может быть более крупных размеров. Предобработка зависит от вида растения и может включать различные методики: предварительный рост материала до нескольких недель на среде при наличии криопротекторов и высоком содержании сахарозы, кратковременная обработка криопротекторами и др.

Хранится материал неограниченно долгое время. Так, например, в криобанке Института физиологии растений РАН имеются клетки моркови, хранящиеся около 20 лет, меристемы картофеля — более 10 лет и др. Регенерация растений из меристем и последующий их анализ показали, что полученный материал не отличается от исходного. Оттаивание материала производится быстро при температуре 40−60 ⁰ С.

Технологии in vitro для поддержания генколлекций используется в генбанках весьма широко. По данным ФАО, 37 600 образцов сохраняются in vitro во всем мире, причем число генбанков и количество образцов с каждым годом увеличивается. В Риме создан Международный Институт генетических ресурсов растений, котoрый координирует работу международных и национальных генцентров по сохранению генколлекций, в том числе и методом in vitro.