Изучение чувствительности Atopobium vaginae к деквалиния хлориду

История вопроса. Atopobium vaginae и Gardnerella vaginalis являются основными маркерами бактериального вагиноза. Целью исследования было определение диапазонов минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и минимальной бактерицидной концентрации (МБК) для антибактериальных веществ широкого спектра действия и антисептика деквалиния хлорида по отношению к 28 штаммам микроорганизмов, принадлежащих к 4 видам рода Atopobium, а именно A. vaginae, A. minutum, A. rimae и A. parvulum. Методы. МИК определялась в специальной среде с микроразведением.

Результаты. МИК и МБК деквалиния хлорида для Atopobium spp. варьировали между <0,0625 и 2 мкг/мл.

Выводы. Исследование показало, что деквалиния хлорид ингибирует и убивает клинически изолированные штаммы A. vaginae в концентрациях, подобных клиндамицину и меньших, чем при использовании метронидазола.

Бактериальный вагиноз (БВ) является полимикробным состоянием, при котором лактобациллы перестают быть преобладающей частью микрофлоры влагалища, а количество анаэробов, таких, как Atopobium vaginae и Gardnerella vaginalis, возрастает [1, 2]. БВ является наиболее распространенной причиной вагинальных выделений среди женщин детородного возраста [3].

На данный момент существуют два рекомендуемых метода лечения БВ: с применением метронидазола перорально и клиндамицина вагинально [4], при этом для обоих препаратов эффективность терапии на протяжении одного месяца составляет от 60% до 90% [5, 6]. Однако частота рецидивов БВ остается высокой, у 30−50% женщин рецидивы наблюдаются через 2−3 месяца после проведенной терапии, а у 50−70% - в течение 6−12 мес [3, 5, 6]. Существуют данные о резистентности БВ-ассоциированных анаэробных бактерий к метронидазолу (1%) по сравнению с 17% базовой резистентностью к клиндамицину, которая возрастала до 53% при повторных курсах терапии [7]. Кроме того, ряд авторов приводят данные о резистентности А. vaginae к метронидазолу [8−10].

Поскольку клиническая и микробиологическая эффективность терапии БВ метронидазолом, другими 5-нитроимидазолами и клиндамицином не является полностью удовлетворительной, характеризуется высокой частотой рецидивов [3, 5−9], то альтернативные методы лечения, такие, как местное применение антимикробных препаратов широкого спектра действия и антисептиков, могли бы предложить решение для нивелирования возможной резистентности к антибиотикам.

Одним из таких антисептиков является деквалиния хлорид, который имеет широкий спектр бактерицидной активности против аэробных и анаэробных бактерий, а также дрожжевых грибов [11], клиническая эффективность и безопасность которого при лечении БВ и других вагинальных инфекций, была установлена ранее [12−14].

Цель исследования: определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и минимальной бактерицидной концентрации (МБК) деквалиния хлорида для штаммов микроорганизмов рода Atopobium.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы

Три штамма A. vaginae (CCUG 44 258, CCUG 44 125 и CCUG 38 953^T) и по одному штамму А. minutum (CCUG 31 167), А. rimae (CCUG 31 168), А. parvulum (CCUG 32 760), Bacteroides fragilis АТСС 25 285^T были получены из банка культур университета Гетеборга, Швеция (CCUG).

Остальные изученные штаммы были выделены клинически в ходе исследования в период с 2003 по 2010 г. (табл. 1), переносились в анаэробные условия (при 37 °C в течение не менее 3 дней) и культивировались с использованием Colombia agar (Becton Dickinson (BD), Erembodegem, Бельгия), Schaedler agar (BD) или Tryptic Soy Agar (BD) с добавлением 5% овечьей крови. Все штаммы были идентифицированы с помощью 16S рРНК-геной последовательности.

Микроразведений раствор для анализа

10 240 мкг/мл исходного раствора деквалиния хлорида готовили путем растворения 102,4 мг деквалиния хлорида в 10 мл воды, прошедшей высокоэффективную жидкостную хроматографию. Деквалиния хлорид растворяли с помощью ультразвука (Labsonic 1510, B. Брауэра Melsungen, Germany) в течение 5 мин при 150 Вт и инкубации на водяной бане (37°C) в течение 2 ч. бактерицидный антисептик микроорганизм atopobium.

Серия разведений в пределах 512 мкг/мл — 0,0625 мкг/мл деквалиния хлорида была использована и тестирована в двух экземплярах.

Подготовленный Brucella agar был дополнен витамином К (1 мкг/мл), гемином (5 мкг/мл) и очищенной лошадиной кровью (5%) [10] и перед использованием в течение 2 ч находился в анаэробной камере при 37 °C. Все штаммы Atopobium spp. высевали на Colombia agar и культивировали в течение 72 ч в анаэробной камере (BugBox, LedTechno, Heusden-Zolder, Бельгия) при 37 °C. Каждый штамм суспендировали в физиологическом растворе до 1-й плотности по McFarland (3×10⁸cfu/ml), 1 мл полученной суспензии центрифугировали в течение 5 мин при 7000 дж, затем 900 мкл суспензии удалялись. Оставшиеся 100 мкл бактериальной суспензии вносили в 5 мл предварительно подготовленного Brucella agar в анаэробной камере при температуре 37 °C с получением конечной нагрузки 6×10⁶ КОЕ/мл (колониеобразующая единица/ мл) и гомогенизировали.

Для каждого из шести штаммов были использованы два титрационных 96-луночных микропланшета (Axygen, СанФранциско, Калифорния). Планшет 1,1 содержал концентрации деквалиния хлорида от 512 мкг/мл до 8 мкг/мл в рядах от A до G и не содержал препарат в ряде H.

Планшет 1,2 содержал от 4 мкг/мл до 0,0625 мкг/мл деквалиния хлорида в рядах от, А до G и не содержал препарат в ряде H.

Таблица 1 Значения МИК и МБК деквалиния хлорида для 4 видов рода Atopobium

Колонки двух 96-луночных планшетов были заполнены 100 мкл бактериальной суспензии с Brucella agar.

Инокулированные планшеты инкубировали при соблюдении анаэробных условий при 37 °C, результаты оценивали через 48 и 72 ч.

Конечная точка МИК была определена как наименьшая концентрация деквалиния хлорида, которая ингибирует видимый рост тест-образцов. Коричневые, темнокрасные лунки рассматривались как лунки без роста бактерий, лунки ярко-красного цвета считались лунками с ростом (рисунок).

Из каждой лунки планшетов 1,1 и 1,2 высевали по 25 мкл раствора на чашки с Colombia agar (т.е. твердую питательную среду без деквалиния хлорида) с последующим инкубированием в течение 72 ч в анаэробной камере при 37 °C для подтверждения наличия или отсутствия роста микроорганизмов и определения МБК.

Клиндамицин и метронидазол также тестировали с соблюдением аналогичных условий для определения МИК для А. vaginae CCUG 44 258, CCUG 44 125, CCUG 38953T и B. fragilis ATCC 25285T.

Результаты исследования и их обсуждение

Значения MИК и MБК 28 штаммов Atopobium для деквалиния хлорида приведены в табл. 1.

Величины MИК и МБК для деквалиния хлорида были определены в диапазоне <0,0625−2 мкг/мл со значением МИК-90 в 2 мкг/мл.

Посевы из всех лунок, в которых на основе цвета (яркокрасный цвет) был определен рост бактерий, при последующем культивировании на твердой питательной среде без деквалиния хлорида показали рост бактерий.

Таблица 2 Сравнение МИК (мкг/мл) для клиндамицина и метронидазола в отношении А. vaginae и B. fragilis.

Примечание: МИК: минимальная ингибирующая концентрация; NT: не тестировалось. «Институт клинических и лабораторных стандартов, раствор с микроразведением; ^ьмєтод разведения агара; «Е-тест* Диапазон на основе МИК 232 клинических изолятов B. fragilis (типы штаммов не были включены).

Посевы из лунок, в которых визуальная оценка показала отсутствие роста (коричневый темно-красный цвет ростовой среды в лунке) при последующем культивировании на твердой питательной среде без деквалиния хлорида соответственно не показали роста.

Полученные результаты свидетельствует о том, что значения МИК аналогичны МБК, то есть деквалиния хлорид оказывает не только бактериостатическое, но и бактерицидное действие.

МИК для клиндамицина и метронидазола в отношении А. vaginae CCUG 44 258, 44 125 и 38953T были сопоставимы с результатами, полученными других исследованиях [8, 15] (табл. 2). МИК для метронидазола в отношении B. fragilis АТСС 25285T соответствовала ранее представленным результатам [15] (см. табл. 2).

Петерсен и соавторы (2002) оценивали терапевтическую эффективность 10 мг деквалиния хлорида в популяционном исследовании с участием 121 пациентки с различными вагинальными инфекциями (бактериальный вагиноз, вульво-вагинальный кандидоз, трихомониаз) по данным мониторинга клинических симптомов, рН влагалища и количества лактобацилл. Авторами отмечен положительный эффект деквалиния хлорида в отношении восстановления экосистемы влагалища и хорошая переносимость препарата при минимальном числе побочных еффектов [13].

Вместе с уже изученным широким спектром антибактериальной активности деквалиния хлорида в отношении различных микроорганизмов, ассоциированых с развитием БВ (Gardnerella vaginalis, Bacteroides spp., Prevotella spp.) [11, 12], наши данные относительно чувствительности А. vaginae к деквалиния хлориду подтверждают возможность использования препарата в качестве альтернативного метода лечения БВ и вагинальных инфекций.

Изменение цвета среды, который мы наблюдали при росте бактерий или его отсутствии, было эффективно для определения концентраций MИК, при этом в других публикациях, которые касались определения значений МИК, данный метод ранее не упоминался.

Выводы

Полученные данные позволили сделать вывод, что деквалиния хлорид ингибирует и убивает клинические изоляты А. vaginae в концентрациях, подобных клиндамицину и меньших, чем метронидазол [8, 15].

• 1. Hillier SL, Holmes KK, Marrazzo JM: Bacterial vaginosis. In Sexually transmitted diseases. 4 edition. Edited by: Holmes KK. New York: McGraw-Hill; 2008:737−68.
• 2. Verhelst R, Verstraelen H, Claeys G, Verschraegen G, Delanghe J, Van Simaey L, De Ganck C, Temmerman M, Vaneechoutte M: Cloning of 16S rRNA genes amplified from normal and disturbed vaginal microflora suggests a strong association between Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis and bacterial vaginosis. BMC Microbiol 2004, 4:16.
• 3. Verstraelen H, Verhelst R: Bacterial vaginosis: an update on diagnosis and treatment. Expert Rev Anti Infect Ther 2009, 7:1109−1124.
• 4. Workowski KA, Berman SM: Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2006. MMWR Recomm Rep 2006, 55(RR-11):1−94.
• 5. Bradshaw CS, Morton AN, Hocking J, Garland SM, Morris MB, Moss LM,

Horvath LB, Kuzevska I, Fairley CK: High recurrence rates of bacterial vaginosis over the course of 12 months after oral metronidazole therapy and factors associated with recurrence. J Infect Dis 2006, 193:1478−1486.

• 6. Larsson PG, Forsum U: Bacterial vaginosis-a disturbed bacterial flora and treatment enigma. APMIS 2005, 113:305−316.
• 7. Beigi RH, Austin MN, Meyn LA, Krohn MA, Hillier SL: Antimicrobial resistance associated with the treatment of bacterial vaginosis. Am J Obstet Gynecol 2004, 191(4):1124−1129.
• 8. De Backer E, Verhelst R, Verstraelen H, Claeys G, Verschraegen G, Temmerman M, Vaneechoutte M: Antibiotic susceptibility of Atopobium vaginae. BMC Infect Dis 2006, 6:51.
• 9. Bradshaw CS, Tabrizi SN, Fairley CK, Morton AN, Rudland E, Garland SM: The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J Infect Dis 2006, 194:828−836.
• 10. Ferris MJ, Masztal A, Aldridge KE, Fortenberry JD, Fidel PL Jr, Martin DH: Association of Atopobium vaginae, a recently described metronidazole resistant anaerobe, with bacterial vaginosis. BMC Infect Dis 2004, 4:5.
• 11. Della Casa V, Noll H, Gonser S, Grob P, Graf F, Pohlig G: Antimicrobial activity of dequalinium chloride against leading germs of vaginal infections. Arzneimittelforschung 2002, 52:699−705.
• 12. Strecker M, Kokemohr H, Teucher T, Schmitz H: Antiseptika gegen vulvovaginitiden. TW Gyrfflkologie 1993, 6:409−412.
• 13. Petersen EE, Weissenbacher ER, Hengst P, Spitzbart H, Weise W, Wolff F, Dreher E, Ernst U, Della Casa V, Pohlig G, Graf F, Kaiser RR: Local treatment of vaginal infections of varying etiology with dequalinium chloride or povidone iodine. A randomised, double-blind, active-controlled, multicentric clinical study. Arzneimittelforschung 2002, 52:706−715.
• 14. Weissenbacher ER, Donders G, Unzeitig V, Martinez de Tejada B, Gerber S, Hala^ka M, ftpanek J, Fluomizin Study Group: A comparison of dequalinium chloride vaginal tablets (fluomizin) and clindamycin vaginal cream in treatment of bacterial vaginosis: single blind, randomized clinical trial of efficacy and safety. Gynecol Obstet Invest.
• 15. De Backer E, Dubreuil L, Brauman M, Acar J, Vaneechoutte M: In vitro activity of secnidazole against Atopobium vaginae, an anaerobic pathogen involved in bacterial vaginosis. Clin Microbiol Infect 2010, 16:470−472.

Karlowsky JA, Walkty AJ, Adam HJ, Baxter MR, Hoban DJ, Zhanel GG: Prevalence of Antimicrobial Resistance among Clinical Isolates of Bacteroides fragilis group in Canada in 2010;2011: CANWARD Surveillance Study. Antimicrob Agents Chemother. Флуомізин