Потенциал модуляторов систем внутренней защиты как противоинфекционных препаратов

Фундаментально новая стратегия при лечении инфекционных заболеваний представляет из себя модулирование иммунного ответа хозяина для усиления элиминации инфекционных возбудителей и снижения повреждения тканей, связанного с воспалением. Противомикробные пептиды иммунной системы хозяина изучали на предмет использования их потенциала в качестве нового класса противомикробных препаратов. И только недавно их иммуномодулирующую активность начали признавать. Модулирование врожденного иммунитета при помощи синтезированных пептидов защитной системы, называемых модуляторами систем внутренней защиты (МСВЗ), несет защитный эффект без непосредственного противомикробного действия. Мы обсуждаем потенциал и существующие ограничения для изучения иммуномодулирующей активности МСВЗ как новых механизмов противоинфекционной защиты. МСВЗ являются перспективными направлением исследований и настоящая работа раскрывает механистические данные, которые помогут при изучении в будущем МСВЗ для клинического применения.

Инфекционные заболевания и иммуномодулирующая терапия Инфекционные заболевания остаются основной причиной смерти и значительного бремени для систем здравоохранения по всему миру [1]. Например, пандемия ВИЧ продолжает ежегодно забирать жизни до двух миллионов человек, при этом по расчетным данным во всем мире проживает примерно 33 миллиона человек, живущих с ВИЧ/СПИД [2], а совсем недавно появились новые патогены для человека, например, коронавирус, ассоциированный с тяжелым острым респираторным синдромом (SARS), и птичий грипп H5N1 [3]. Прочие инфекционные заболевания, включая туберкулез и заболевания ЖКТ, остаются ведущими причинами смерти [2]. Опасность также представляет распространение инфекционных возбудителей в новые географические регионы, как показывает пример недавних случаев заражения вирусом Западного Нила в Северной Америке [3]. Кроме того, быстрое развитие антибиотикорезистентности у многих бактериальных патогенов создает необходимость в срочном появлении новых противомикробных препаратов и стратегий при лечении инфекционных заболеваний [4]. иммунный инфекционный возбудитель воспаление Наши быстро пополняемые знания об иммунной системе создают новые возможности для разработки иммуномодулирующих методов лечения [5,6]. В отличие от стандартных антибиотиков, которые созданы с прицелом на какой-либо патоген, такие новые методы реализуют свое протективное действие посредством влияния на иммунную систему хозяина. Многие методы лечения, мишенью действия которых является иммунная система, уже вошли в клинику за последние десятилетия и еще больше находится на этапе клинических исследований.

Сюда входят и иммуносупрессивные препараты для применения при трансплантации тканей, при аутоиммунных и воспалительных заболеваниях, и соединения, разработанные с целью стимулировать иммунный ответ, например, адъюванты вакцин. Хотя на этапе исследований находится громадное количество соединений, большинство препаратов, разрешенных к применению, в настоящее время относятся к одному из следующих классов: моноклональные антитела, лиганды Toll-подобных рецепторов (TLR) и их производные, цитокины и хемокины, а также малые молекулы.

Моноклональные антитела используются в клинике для стимуляции или выключения рецепторов на клеточной поверхности, инактивации цитокинов и прочих молекул в кровоток, и доставки антигенов к дендритным клеткам либо направлении токсинов к клеткам опухоли [5]. Лиганды TLR применяются в связи с их иммуностимулирующими эффектами [7,8]. Например, лиганд TLR4 монофосфорил липид-А (MPL) используется в качестве адъюванта в вакцинах против вируса гепатита В (HBV) и вируса папилломы человека (HPV) [9,10]. Кроме того, агонист TLR7 имиквимод разрешен к применению в качестве препарата местного лечения при индуцированных HPV остроконечных кондилом и при базальноклеточной карциноме. Также на этапе клинических исследований находятся различные соединении, разработанные для стимуляции TLR3, TLR5, TLR7/8 и TLR9, в основном в качестве адъювантов для вакцин против хронических вирусных инфекций или вспомогательных препаратов при химиотерапии рака [7,8].

В качестве примера иммунотерапевтического применения цитокинов, хемокинов и гормонов можно назвать интерфероны I типа при лечении хронического гепатита В, гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) — для лечения нейтропении, и глюкокортикоиды — для лечения астмы и прочих хронических воспалительных заболеваниях [11]. При стандартном применении для малых молекул мишенью является пути внутриклеточной передачи сигналов [12]. Например, отторжение трансплантированного органа может быть ограничено посредством ингибирования мишени у млекопитающих для рапамицина (mTOR) при помощи рапамицина или посредством ингибирования кальциневрина при помощи циклоспорина или FK506, что приводит к подавлению передачи T-клеточных сигналов. Многие другие малые молекулы, действие которых направлено на компоненты путей передачи сигналов, например тех, в которых участвует ядерный фактор kB (NFkB), p38 митоген-активированная протеин киназа (MAPK) и трансдукторы сигнала киназы Януса и активаторы транскрипции (JAK-STAT), также проходят клинические исследования [12]. Перенос родственных дендритных клеток [13] и аутологичных цитотоксических Т-клеток [14], что является эффективным при некоторых формах рака, также можно считать иммунотерапевтическим методов лечения.

Вставка 1. Системный биологический подход к изучению иммуномодулирующей активности Разработка лекарственных препаратов и сложные системы Собственная иммунная система человека представляет собой очень сложную, нелинейную сетевую структуру, обладающую громадным потенциалом в отношении незначительных модификаций путей передачи сигналов, что затем приводит к выработке цитокинов с далеко идущими последствиями для дальнейших реакций в виде изменений, которые могут быть и благоприятными, однако не являются целиком предсказуемыми, желательными или контролируемыми [21]. Как недавно обсуждалось в работе Шадта и соавт. [20], прогресс в поиске и разработке лекарственных средств требует целостного подхода, принимающего во внимание нелинейные причинно-следственные связи, присущие сложным системам. Данная концепция подходит, в частности, к иммуномодуляции, поскольку процессы перекрестного взаимодействия между путями передачи сигналов в ней весьма выражены. Невозможно смоделировать целиком собственную иммунную систему человека либо in vitro, либо в виде компьютерной модели; тем не менее, системный биологический подход может помочь нам в понимании сложных взаимодействий и работы путей передачи сигналов. Попытки понять вероятные эффекты иммуномодулирующих препаратов требуют понимания связанных с этим взаимодействий в пределах иммунной системы как единого целого и их эффектов на другие крупные системы, такие как систему метаболизма и гормональные и нейрональные пути передачи сигналов.

Компьютеры как средство помощи при использовании системных биологических методов Существует множество бесплатных и коммерческих биоинформационных инструментов и баз данных, предназначенных для поиска и анализа данных по многим аспектам биологических систем. Особый интерес при разработке иммуномодулирующих препаратов представляют те, в которых включены следующие сведения:

Интерактомные данные, относящиеся к естественному иммунитету, такие как InnateDB (www.innatedb.com), вручную заполняемая база данных и аналитическая платформа для генов, белков, взаимодействий, путей передачи сигналов и ответов на сигналы в случае естественного иммунного ответа у человека и мышей;

Иммунологически-специфические данные, особенно относящиеся к иммунитет-релевантному транскриптомному анализу, например, Innate Immunity Database (http://db.systemsbiology.net/IIDB);

Данные о путях взаимодействия, например, NCI-Nature Pathway Interaction Database (http://pid.nci.nih.gov); и Инструменты для анализа взаимодействия конкретных белков, например, IntAct (http://www.ebi.ac.uk/intact/).

Разработка и использование InnateDB [51], которая включает данные из множества бесплатных баз данных и в которой имеется вручную вводимые данные о взаимодействиях, аналитические инструменты и визуализационные функции, обеспечивает возможность детального рассмотрения путей передачи сигналов и потенциальных эффектов на последующие реакции пептидных препаратов. Например, мы недавно сообщали о применении такого метода для изучения LL-37, с экспериментальной верификацией биоинформационных прогнозов [52]. По видимому, такая система может использоваться совместно с массивом генов или протеомическими данными с тем, чтобы помочь в разработке итеративного и обоснованного дизайна исследования и тестирования иммуномодулирующих пептидов посредством анализа того, как индивидуальные пептиды могут повлиять на различные пути передачи сигналов. Анализ путей передачи и онтологический анализ также могут позволить выяснить специфические биологические процессы, связанные с эффектами таких белков.

Хотя многие методы иммунотерапии разрешены к применению в клинике, а многие другие уже показали свою эффективность в клинических исследованиях, существует множество проблем, которые мешают их широкому использованию. Применение иммуносупрессивных препаратов часто связано с повышением риска развития инфекционных осложнений и может также повышать предрасположенность пациента к развитию опухолей [15,16]. Иммуностимулирующие методы лечения могут в результате привести к развитию воспалительного повреждения тканей, аутоиммунным реакциями или потенциально смертельной цитокиновой буре [17,18]. Эти риски ограничивают возможности по применению большинства иммунопрепаратов только угрожающими жизни состояниями, при которых отсутствуют методы лечения с более высокой переносимостью. Также все больше специалистов признает, что большинство состояний невозможно излечить посредством нецеленаправленной иммунной стимуляции или супрессии, что подтверждается неэффективностью иммуносупрессивной терапии при сепсисе [19]. Таким образом, нам необходимо разработать инструменты, которые позволят точно контролировать, модулировать и/или ориентировать иммунные реакции. Чтобы иметь перспективы применения в коммерческих целях, идеальные препараты также должны обладать широким спектром действия и иметь в качестве мишени целый класс связанных состояний или патогенов. Эти проблемы подчеркивают значимость изучения иммунной системы с точки зрения системной биологии, чтобы получить возможность прогнозировать исходы и эффективность применения иммуномодулирующих препаратов [20,21]. Эти вопросы обсуждаются в Таблице 1.

Пептиды защитной системы хозяина: многофункциональные медиаторы естественного иммунитета Белки иммунной системы (БИС) (также известные под именем противомикробных пептидов) изучаются как потенциальные иммунотерапевтические препараты, поскольку они обладают уникальной комбинацией иммуностимулирующих и противовоспалительных признаков [6,22]. БИС производятся иммунной системой всех многоклеточных организмов и чрезвычайно широко отличаются и по последовательности, и по структуре. Несмотря на эти отличия, большинство пептидов представляется собой амфипатические молекулы, с общим положительным зарядом, и высоким содержанием катионных и гидрофобных аминокислот. Классы пептидов, такие как кателицидины [23], дефензины [24] и гистатины [25], различают по их последовательностям, структуре или механизму генерации. Общие свойства кателицидинов и дефензинов представлены на Вставке 2. У млекопитающих эти пептиды, как правило, производятся лейкоцитами, эпителиоцитами слизистой и кератиноцитами.

У многих БИС выявляется микробицидная активность с широким спектром либо по механизму взаимодействия с последующим разрушением микробных мембран, либо транслокации в бактериальную клетку и последующим взаимодействием с внутриклеточными мишенями [26]. Несомненно, это играет ключевую роль при реализации иммунных механизмов в некоторых локациях, например, в фаголизосомах лейкоцитов или криптах тонкого кишечника. Тем не менее, микробицидная активность пептидов имеет высокую чувствительность к противодействию бивалентных катионов, сывороточных и анионных макромолекул, таких как глюкозаминогликаны [27], и, таким образом, их иммуномодулирующая активность, вероятно, более существенна во многих прочих физиологических условиях. Иммуномодулирующая активность БИС включает в себя также и различные эффекты на миграцию клеток, выживаемость и пролиферацию, а также индукцию множества противомикробных и иммунных медиаторов.

Вставка 2. Пептиды защитной системы хозяина Кателицидины — это катионные амфипатические пептиды разнообразной линейной, б-спиральной или в-шпилькообразной структуры, и появляются как результат протеолиза C-конца предшественника белка, содержащего кателиновый домен [23]. У человека имеется только один предшественник кателицидинов, hCAP18, который производится, в основном, в лейкоцитах и эпителиальных клетках. Он расщепляется с образованием пептида LL-37 и, в некоторых тканях, целого набора более коротких пептидов с измененными свойствами [35]. У мышей также производится только один кателицидин, CRAMP, тогда как у крупного рогатого скота и свиней пептидное семейство является весьма разнообразным.

Дефензины — это катионные амфипатические пептиды длиной примерно в 30 аминокислот и трехнитевой в-пластинчатой структурой, содержащей три дисульфидные связи [24]. На основании способа дисульфидного связывания дефензины разделяют на семейства — б-, ви реже встречающиеся и-дефензины. У человека б-дефензины производятся в азурофильных гранулах нейтрофилов как часть их противомикробного арсенала, и в клетках Панета крипт кишечника, а также в других лейкоцитах и эпителиоцитах, тогда как в-дефензины производятся в эпителии слизистых, коже и в некоторых лейкоцитах. И-дефензины — это циклические пептиды с высокой анти-ВИЧ активностью, которые не производятся у человека и пока были выявлены только у обезьян Старого Света [53].

Таблица 1 — Иммуномодулирующие свойства пептидов иммунной системы млекопитающих.

Среди мишеней эффектов пептидов — лейкоциты, эпителиоциты слизистых, кератиноциты и клетки сосудистого эндотелия (Таблица1). Высокое разнообразие по последовательностям и многофункциональная природа БИС дает большие возможности для конструирования искусственных пептидов и их производных с терапевтическими целями [6,22].

Стратегии и проблемы конструирования и скрининга РВИ Терапевтический потенциал пептидов с прямым противомикробным действием уже хорошо изучен и некоторые из таких пептидов уже находятся на этапе клинических исследований; однако иммуномодулирующее действие БИС все еще не исследовано до такой степени. Один из первых синтетических иммуномодулирующих пептидов на основании модели БИС (т.е. таковой для малого бычьего БИС, бактенецина [28]), модулятор системы внутренней защиты 1 (МСВЗ-1), может опосредовать in vivo защитные реакции против бактериальной нагрузки при отсутствии прямого противомикробного действия [29]. Было сделано предположение, что этот механизм действия включает усиленную хемокиновую продукцию вместе с модулированием эффектов провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухолей б (ФНО-б) и опосредуется посредством модулирования специфических внутриклеточных путей передачи сигналов. Такая активность представляет собой серьезное обоснование для применения БИС при разработке синтетических пептидов с оптимизированными иммуномодулирующими свойствами. Схематический обзор применяемого в настоящее время подхода к конструированию МСВЗ показан на Рис. 1.

Важным аспектом для разработки иммуномодулирующих пептидов является разработка и валидация техник их скрининга. Высокопроизводительный скрининг in vitro для антибактериальной активности применяли для валидации и итеративной оптимизации научно сконструированных противомикробных пептидов [30,31]. Посредством применения больших наборов данных, что стало возможным благодаря высокопроизводительному скринингу пептидных библиотек, мы смогли идентифицировать индивидуальные физические характеристики, которые хорошо коррелируют с прямыми противомикробными эффектами. В противоположность этому, благодаря сложности взаимодействий между множеством типов клеток и эффекторных молекул, не представляется возможным скринировать малозаметные иммуномодулирующие эффекты in vitro и для выявления таких эффектов необходимо использоваться суррогатные маркеры. Вместо этого нужно использовать скрининговые методы, которые коррелируют с улучшением работы защитной системы.

Рисунок 1. Техники конструирования МСВЗ.

Конструирование и тестирование МСВЗ — это итеративный процесс. Исходные пептиды-кандидаты основаны на природных БИС, сконструированных при помощи компьютерных инструментов или сгенерированных случайным образом. Эти пептиды-кандидаты тестируются in vitro и in vivo, а затем при помощи компьютерного анализа выбираются свойства, ассоциированные с функцией. Новые пептиды-кандидаты могут затем быть разработаны с применением этих данных о взаимосвязи структуры и функции, а дальнейшие тесты раскрывают новые сведения. Данные тестирования in vitro и in vivo также влияют на исследования механизмов действия МСВЗ, а эти сведения, в свою очередь, могут быть использованы при использовании метода биоинформационного и компьютерного конструирования. Структурная диаграмма — это LL-37, взятый из Банка данных исследовательской сети структурной биоинформатики белков (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank).

Например, МСВЗ-1 был выбран на основании его иммуномодулирующих эффектов in vitro, а именно — усиления выброса хемокинов из стимулированных пептидом мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК) [29] и за его способность защищать мышей против бактериальных инфекций. Другой возможный тест — способность подавлять индукцию ФНО-б в ответ на введение агонистов TLR [32]. Даже при использовании таких маркеров, пептиды-кандидаты должны, в итоге, проходить тестирование in vivo, поскольку системы изолированных клеток не позволяют воспроизвести естественный иммунный ответ во все его полноте. Таким образом, по сравнению с тестированием противомикробной активности, для которой часто имеется сильная корреляция эффектов в условиях in vitro и in vivo, намного дороже и трудозатратнее получить большие объемы наборов данных, необходимые для применения компьютерных методик в отношении конструирования иммуномодулирующих пептидов. Несмотря на такие проблемы, в настоящее время имеется уже несколько прецедентов. Например, синтетические эндотоксин-связывающие пептиды были оптимизированы для обеспечения защитных эффектов in vivo [33], а фрагмент БИС человека LL-37 был оптимизирован для реализации анти-эндотоксиновых эффектов при помощи замещения соответствующих аминокислот [34]. Галло (Gallo) и соавт. [35] впоследствии разнесли слабые антимикробные и иммуномодулирующие свойства LL-37 по отдельным усеченным пептидам, полученным на основе LL-37. В определенных исследованиях была оптимизирована активность более мелких бактеницинои индолициноподобных синтетических пептидов как компонентов адъювантных препаратов (поскольку врожденные иммунные механизмы управляют реакциями приобретенного иммунитета) при помощи скрининга на наличие хемокин-индуцирующей активности и затем проведения по ней анализа in vivo [36−38].

Одной из проблем для научно обоснованного конструирования МСВЗ является идентификация их индивидуальных взаимодействующих партнеров. На сегодняшний момент уже выявлено несколько рецепторов для пептидов [39]. Тем не менее, они являются внеклеточными рецепторами, а известно, что БИС обладают свойствами белков, проникающих через клеточную мембрану [40]. Действительно, было показано, что МСВЗ-1 также захватывается клетками, а это действие необходимо для реализации его хемокин-индуцирующих эффектов [29]. Мы предполагаем, что все МСВЗ-подобные пептиды попадают в клетку и взаимодействуют с конкретными клеточными компонентами с последующей модуляцией внутриклеточных путей передачи сигналов в иммунных клетках, и недавно мы выявили два таких внутриклеточных рецептора (неопубликованные данные и ссылка [41]); также мы подозреваем, что имеется множество рецепторов для каждого типа МСВЗ и БИС. Как только будут определены все участники взаимодействия, мы сможем проектировать пептиды с определенной конформацией, гидрофобными свойствами и/или зарядом в рамках исследований связывания с клетками, хотя необходимость захвата молекулы клеткой может налагать определенные ограничения на конструирование пептидов. В отсутствие таких данных итеративная оптимизация посредством замещения аминокислот и скрининга представляется наиболее эффективной стратегией.

Животные модели также представляют определенные сложности для тестирования иммуномодулирующих препаратов. В иммунной системе различных млекопитающих отличаются существенным образом и поэтому конкретные пептиды, обладающие мощными защитными свойствами у мышей, могут не давать такого же эффекта у человека. Для решения этой проблемы может потребоваться использовать первично человеческие клетки, например, МКПК, для проведения исследований in vitro и для выявления параллельных данных в инфекционных исследованиях на животных. Тем не менее, как обычно для новых препаратов, эффективность на человеке невозможно подтвердить до начала клинических исследований таких препаратов.

В клинических исследованиях уже была показана безопасность трех иммуномодулирующих катионных пептидов. Два из них, MX-226 и hLF1−11, исходно изучались как противомикробные пептиды. Однако было выявлено, что первый является безопасным только при местном применении, и показал эффективность в клинических исследованиях II фазы в отношении и воспалительных последствий тяжелой угревой сыпи, и неинфекционного заболевания кожи, розацеа. Была показана безопасность системного применения hLF1−11 у реципиентов с нарушением иммунной защиты после трансплантации стволовых гематопоэтических клеток. Другой интересный пептид, RDP58, который получен из тяжелой цепи молекул HLA I класса, также показал свою безопасность в клинических исследованиях (хотя большая часть данных об этом белке не предоставлены широкой публике) [42]. По данным Genzyme Corporation (http://www.genzyme.com/corp/licensing/gen-z_p_rdp58_login.asp), RDP58 усиливает оксигеназную активность гемма и ингибирует воспалительные реакции в ответ на такие стимулы, как липополисахарид (ЛПС), фитогемагглютинин (ФГА), двуцепочечная РНК и цитокины, например, ФНО-б и интерлейкин (ИЛ)-1 В. RDP58 снижает продукцию провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-б, интерферон (ИФН)-г и ИЛ-12, однако не влияет на продукцию нескольких других цитокинов, включая ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-10. Предполагаемый механизм действия подразумевает воздействие на внутриклеточные пути передачи сигналов, хотя конкретные подробности и участники их в настоящее время не выяснены [42].

Тогда как и МСВЗ-1, и RDP58 являются катионными белками, они могут быть способны модулировать врожденные иммунные реакции на воспалительные стимулы по разному. Оба пептида подавляют индукцию определенных провоспалительных цитокинов, например ФНО-б, однако их действие на прочие цитокины различается. Например, RDP58 не влияет на продукцию ИЛ-6 или ИЛ-10, тогда как МСВЗ-1 ее усиливает. Четкие реакции на эти пептиды показывают ценность различных стратегий проектирования белков, поскольку разработка RDP58 базировалась на молекулах HLA I класса, а структура МСВЗ-1 была основана на таковой бычьего кателицидина. Важно, что такой диапазон потенциальных эффектов показывает, что если мы может понять все хитросплетения иммуномодулирующих белковых взаимодействий с компонентами и путями передачи сигналов в клетках хозяина, то может быть возможно создать пептиды с заданными иммуномодулирующими эффектами для лечения различных заболеваний (Вставка 3).

Клиническое применение иммуномодулирующих пептидов Иммунотерапия, основанная на пептидах, все еще находится в грудном возрасте, и, соответственно, у нас имеется весьма ограниченный клинический опыт, на который мы могли бы опереться, и мы вынуждены рассматривать всю область иммуномодуляторов в общем [6]. При клинической оценке иммунотерапевтических средств необходимо понимать, что они отличаются от традиционных фармакологических препаратов, поскольку иммунная система самоусиливает свои реакции, чтобы быстро подавить потенциальных возбудителей инфекционного процесса, которые размножаются экспоненциально.

Возможно, наивно полагать, что иммуномодулирующие препараты будут обладать типичной дозозависимой фармакодинамикой. Кроме того, потенциальная возможность нанести вред, в случае возможной несоответствующей стимуляции иммунитета требует осторожного подхода к этим средствам. Иммунные реакции часто являются очень тонко уравновешенными и слишком выраженное нарушение этого баланса может сделать невозможным для системы вернуться в состояние гомеостаза. Незначительные возмущения иммунного гомеостаза, наблюдаемые при доклиническом тестировании, могут транслироваться в катастрофические эффекты на человеке, как мы видели в случае практически летального цитокиновой бури, индуцированной при применении антагониста CD28, TGN1412, в исследованиях I фазы [18].

Поэтому при клинических исследованиях иммуномодуляторов соединения часто оцениваются такими методами, которые позволяют избежать избыточных ответных реакций или их системного всасывания. Например, RDP58, изучаемого в рамках исследования применения при язвенном колите [42], был подвергнут структурной модификации, чтобы предотвратить и его разрушение при протеолизе, и системное всасывание [43]. Два исследования II фазы препарата RDP58 на комбинированной когорте из 127 пациентов показали, что препарат хорошо переносится (уровень нежелательных явлений соответствует таковому у плацебо) и является эффективным в отношении улучшения показателей по данным сигмоидоскопии у пациентов с колитом, получавших его средние и высокие дозы [42]. Считается, что патогенез язвенного колита, как минимум, частично связан с нарушением регуляции реакций хозяина на кишечную микробиоту [44] и, хотя RDP58 изучается по поводу его противовоспалительных свойств, он также, возможно, способен изменять реакции хозяина на микробиоту также, как действуют противоинфекционные пептиды.

Несколько пептидных препаратов с иммуномодулирующим и противомикробным действием перешли на этап клинических исследований в качестве местных антибактериальных препаратов, и у некоторых из них было выявлено иммуномодулирующее (общее противовоспалительное) действие (Таблица 2). Преимущество местного применения — это устранение необходимости демонстрировать системную безопасность препарата. Таким образом, целый ряд пептидов использоваться в качестве местных противомикробных средств, включая пексиганан (MSI-78), омиганан (MX-226), изеганан (IB-367), hLF1−11, XOMA-629 и HB-1345 (Таблица 2). Последующие исследования показали, что MX-226 и hLF1−11 обладают клинически благоприятным иммуномодулирующим действием и что IB-367 снижает уровень ФНО-б в плазме на моделях сепсиса у животных [45]. Недавно было начато проведение клинического исследования III фазы препарата IB-367 по поводу орального мукозиита у пациентов, получавших лучевую терапию по поводу онкологического заболевания, в котором препарат не описывается как противомикробный (http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00022373). На основании этих наблюдений мы считаем, что имеется большая вероятность того, что иммуномодулирующая активность будет играть важную роль для любых клинически благоприятных проявлений при применении катионных белковых препаратов.

Иммуномодулирующие пептиды, которые в настоящее время применяются как противоинфекционные препараты, — это препарат «Глутоксим» (NOV-002), хотя этот пептид и существенно отличается от катионных МСВЗ, описанных выше. Трипептидное производное окисленного глутатиона, Глутоксим в настоящее время назначается в России как дополнительный препарат к традиционным методам лечения у пациентов с легочным и диссеминированным течением инфекции, вызванной Mycobacterium tuberculosis. Добавление Глутоксима к схемам стандартной противотуберкулезной терапии позволяет уменьшить время, необходимое для элиминации бактерий, положительно влияет на время разрешения легочного инфильтрата и повышает уровень интенсивности набора веса по окончании курса лечения [46]. Нежелательные эффекты ограничены транзиторными фебрильными проявлениями, которые разрешаются при отмене препарата. Доклинические исследования на нейтрофилах человека и цельной крови показали наличие иммуномодулирующего механизма действия [47], что позволяет предположить, что иммуномодулирующие пептидные препараты могут быть эффективными и безопасными. В настоящее время Глутоксим находится на III фазе клинических исследований в США как адъювантный препарат при химиотерапии (http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00347412) немелкоклеточного рака легких, а не просто как противомикробный препарат, возможно потому, что заболеваемость туберкулезом в США находится на относительно низком уровне и потенциал возврата инвестиций по данному показанию меньше. Первые результаты представляются многообещающими и говорят о снижении миелосупрессии и модулировании подгрупп лимфоцитов после химиотерапии (www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00347412), что позволяет предположить, что Глутоксим может играть роль и иммуномодулятора при лечении онкологических заболеваний.

Отличная территория, на которой лежат великолепные потенциальные возможности для двойного, противоинфекционного и противовоспалительного действия пептидной иммунотерапии, — это лечение бактериемии и сепсиса. Хотя в настоящее время еще отсутствуют какие либо клинических данные, препарат IMX-942, производное МСВЗ-1, изучается в рамках исследования безопасности I фазы у пациентов, получающих химиотерапию, у пациентов с химиотерапией и фебрильной нейтропенией (http://www.inimexpharma.com). Таким образом, будущее иммуномодулирующих пептидов является вполне радужным.

Ограничения и преимущества МСВЗ Для всех кандидатов в препараты вопросы потенциальной токсичности, стабильности in vivo и соответствующим путей доставки должны быть определяющими. Для антибактериальных препаратов важна роль и потенциала к развитию резистентности. Ясно, что можно создавать МСВЗ без значительной токсичности in vitro или в модели у животных [29], однако все еще имеются вопросы, касающиеся их потенциала в отношении токсичности in vivo (особенно у человека и при многократном введении), соответствующих лекарственных форм и путей введения. Завершение клинических исследований безопасности с пептидными препаратами, показало, что эти пептиды, как минимум, можно безопасно использовать при местном применении. Однако остается открытым вопрос, являются ли такие белки безопасными при введении через другие пути.

Стабильность in vivo и протеолитическое разрушение пептидов — это другие области потенциальных проблем. Хотя малые пептиды, скорее всего, разрушаются в организме хозяина в течение периода от нескольких минут до нескольких часов, результаты исследования МСВЗ-1 показывают, что их применение за 48 ч до и через 6 ч после бактериальной нагрузки все еще оказывает защитные эффекты в моделях у животных [29]. Это вызывает вопрос о том, как пептид, который, как предполагается, должен быстро разрушаться, может обеспечить длительные эффекты и необходимо ли усиление стабильности пептида в таком контексте. Одна из возможностей заключается в том, что пептиды примируют иммунокомпетентных клетки; и действительно, их способность к транслокации в иммунные клетки [40] может защитить их от процессов разрушения белков. Это соответствует наблюдениям, что пептиды являются активными при введении разными путями, и, возможно, указывает на то, такие локально примированные клетки (или клетки, содержащие пептид) перемещаются к очагу инфекции.

Один из способов повысить их стабильность заключается в создании D-аминокислотных форм пептидов, используя специфичность протеаз к L-формам аминокислот.

Таблица 2 — Иммуномодулирующие пептиды в клинических исследованиях.

Поскольку вероятно, что трехмерная структура пептидов важна для их взаимодействий со специфическими рецепторами, она может быть и причиной их инактивации. Эту проблему можно обойти при использовании ретро-инверсных пептидов, включающих D-аминокислоты в обратной последовательности, поскольку это сохраняет пространственное положение боковых цепочек и обеспечивает резистентность к протеазам D-форм аминокислот [48]. Стоимость производства синтетических пептидов очень высока, поэтому важную роль играют и стратегии, направленные на увеличение их биодоступности (т.е. создание подходящих лекарственных форм), также важны для снижения стоимости лечения. Одно чрезвычайно важное свойство МСВЗ заключается в том, что вероятность развития резистентности к ним у микроорганизмов ниже чем при использовании прямых антибактериальных препаратов [49]. Поскольку система врожденного иммунитета развивалась вместе с микробами, незначительное усиление ее реакций не должно привести к интенсификации процессов селективного давления на механизмы избегания действия иммунитета у бактерий. Кроме того, усиление естественных механизмов элиминации микроорганизмов, опосредованное МСВЗ, не должно привести к созданию бактериальных обломков, которые будут стимулировать процессы воспаления в отсутствие живых бактерий [50], что обеспечивает еще одно преимущество по сравнению с традиционными антибактериальными препаратами. И действительно, некоторые из таких пептидов на самом деле подавляют подобные септические воспалительные реакции.

Выводы

Синтетические иммуномодулирующие пептиды МСВЗ обладают значимым потенциалом как антиинфекционные препараты и современные исследования обещают раскрытие ключевых данных, которые должны существенно облегчить разработку оптимизированных МСВЗ. Имеется возможность моделировать структуру МСВЗ под различные задачи, при этом не все они должны иметь антиинфекционную направленность. Способность незначительно изменять нормальный баланс между защитными врожденными иммунными реакциями, например, продукцией хемокинов, и параллельным привлечением лейкоцитов (которое они усиливают), а также потенциально отрицательные эффекты избыточных воспалительных реакций (которые они могут подавлять) обеспечивает уникальную возможность содействовать в рамках реакций врожденного иммунитета борьбе организма с патогенами. Данный подход вряд ли приведет к развитию микробной резистентности к МСВЗ, а также позволяет избежать развития либо полностью подавляет воспаление, связанное с накоплением обломков бактерий, что часто имеет место при применении традиционных антибиотиков. И хотя в данной сфере все еще необходимо проведение большого количества исследований, потенциал такого нового подхода в сфере антиинфекционной терапии громаден.

Положение о раскрытии сведений Р.Е. В. Ханкок является основателем и членом научного консультативного совета компании Inimex Pharmaceuticals Inc., а также держателем акций компании Migenix Inc.

Благодарности

Наши собственные исследования пептидов спонсировались из бюджета Фонда Национальных Институтов Здоровья, Фонда Билла и Мелинды Гейтс, Канадских Институтов медицинских исследований (CIHR) через два отдельных Больших Конкурса в Глобальных инициативах исследований в сфере здравоохранения и дополнительный исследовательский грат от CIHR, а также Genome BC и advanced Foods and Materials Network. A.N. является научным сотрудником с ученой степенью, имеет степень MLM и стипендию MD/PhD от CIHR с дополнительной поддержкой от Фонда медицинских исследований Майкла Смита. R.E.W.H. занимает должность Председателя Собрания исследователей Канады holds a Canada Research Chair.

References

• 1. Rappuoli, R. (2004) From Pasteur to genomics: progress and challenges in infectious diseases. Nat. Med. 10, 1177−1185
• 2. WHO (2008) World Health Statistics 2008, World Health Organisation Press
• 3. Weiss, R.A. and McMichael, A.J. (2004) Social and environmental risk factors in the emergence of infectious diseases. Nat. Med. 10, S70−76
• 4. Spellberg, B. et al. (2008) The epidemic of antibiotic resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America. Clin. Infect. Dis. 46, 155−164
• 5. Waldmann, T.A. (2003) Immunotherapy: past, present and future. Nat. Med. 9, 269−277
• 6. Hamill, P. et al. (2008) Novel anti-infectives: is host defence the answer? Curr. Opin. Biotechnol. 19, 628−636
• 7. Romagne, F. (2007) Current and future drugs targeting one class of innate immunity receptors: the Toll-like receptors. Drug Discov. Today 12, 80−87
• 8. Kanzler, H. etal. (2007) Therapeutic targeting of innate immunity with Toll-like receptor agonists and antagonists. Nat. Med. 13, 552−559
• 9. Pashine, A. et al. (2005) Targeting the innate immune response with improved vaccine adjuvants. Nat. Med. 11, S63−68
• 10. 10 Harper, D.M. et al. (2006) Sustained efficacy up to 4.5 years of a bivalent L1 virus-like particle vaccine against human papillomavirus types 16 and 18: follow-up from a randomised control trial. Lancet 367, 1247−1255
• 11. Viola, A. and Luster, A.D. (2008) Chemokines and their receptors: drug targets in immunity and inflammation. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 171−197
• 12. O’Neill, L.A. (2006) Targeting signal transduction as a strategy to treat inflammatory diseases. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 549−563
• 13. Figdor, C.G. et al. (2004) Dendritic cell immunotherapy: mapping the way. Nat. Med. 10, 475−480
• 14. Rosenberg, S.A. et al. (2008) Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer 8, 299−308
• 15. Dinarello, C.A. (2003) Anti-cytokine therapeutics and infections. Vaccine 21 (Suppl. 2), S24−34
• 16. Askling, J. and Bongartz, T. (2008) Malignancy and biologic therapy in rheumatoid arthritis. Curr. Opin. Rheumatol. 20, 334−339
• 17. Ponce, R. (2008) Adverse consequences of immunostimulation. J. Immunotoxicol. 5, 33−41
• 18. Suntharalingam, G. et al. (2006) Cytokine storm in a phase 1 trial ofthe anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N. Engl. J. Med. 355, 10 181 028
• 19. O’Callaghan, A. and Redmond, H.P. (2006) Treatment of sepsis: current status of clinical immunotherapy. Surgeon 4, 355−361
• 20. Schadt, E.E. et al. (2009) A network view of disease and compound screening. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 286−295
• 21. Brown, K.L. et al. (2007) Complexities oftargeting innate immunity to treat infection. Trends Immunol. 28, 260−266
• 22. Hancock, R.E.W. and Sahl, H.G. (2006) Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nat. Biotechnol. 24, 1551−1557
• 23. Zanetti, M. (2004) Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity. J. Leukoc. Biol. 75, 39−48
• 24. Ganz, T. (2003) Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 3, 710−720
• 25. Kavanagh, K. and Dowd, S. (2004) Histatins: antimicrobial peptides with therapeutic potential. J. Pharm. Pharmacol. 56, 285−289
• 26. Powers, J.P. and Hancock, R.E.W. (2003) The relationship between peptide structure and antibacterial activity. Peptides 24, 1681−1691
• 27. 27 Bowdish, D.M. et al. (2005) Impact of LL-37 on anti-infective immunity. J. Leukoc. Biol. 77, 451−459
• 28. Bowdish, D.M. et al. (2005) Immunomodulatory activities of small host defense peptides. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 1727−1732
• 29. Scott, M.G. et al. (2007) An anti-infective peptide that selectively modulates the innate immune response. Nat. Biotechnol. 25, 465−472
• 30. Cherkasov, A. et al. (2009) Use of artificial intelligence in the design of small peptide antibiotics effective against a broad spectrum of highly antibiotic-resistant superbugs. ACS Chem. Biol. 4, 65−74
• 31. Fjell, C.D. et al. (2009) Identification of novel antibacterial peptides by chemoinformatics and machine learning. J. Med. Chem. 52, 2006;2015
• 32. Mookherjee, N. et al. (2006) Modulation of the TLR-mediated inflammatory response by the endogenous human host defense peptide LL-37. J. Immunol. 176, 2455−2464
• 33. 33 Dankesreiter, S. et al. (2000) Synthetic endotoxin-binding peptides block endotoxin-triggered TNF-alpha production by macrophages in vitro and in vivo and prevent endotoxin-mediated toxic shock. J. Immunol. 164, 4804−4811
• 34. Nagaoka, I. et al. (2002) Augmentation of the lipopolysaccharide-neutralizing activities of human cathelicidin CAP18/LL-37-derived antimicrobial peptides by replacement with hydrophobic and cationic amino acid residues. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9, 972−982
• 35. Braff, M.H. et al. (2005) Structure-function relationships among human cathelicidin peptides: dissociation of antimicrobial properties from host immunostimulatory activities. J. Immunol. 174, 4271 -4278
• 36. Garlapati, S. et al. (2009) Strategies to link innate and adaptive immunity when designing vaccine adjuvants. Vet. Immunol. Immunopathol. 128, 184−191
• 37. Kovacs-Nolan, J. et al. (2009) The novel adjuvant combination of CpG ODN, indolicidin and polyphosphazene induces potent antibodyand cell-mediated immune responses in mice. Vaccine 27, 2055;2064
• 38. Kindrachuk, J. et al. (2009) A novel vaccine adjuvant comprised of a synthetic innate defence regulator peptide and CpG oligonucleotide links innate and adaptive immunity. Vaccine 27, 4662−4671
• 39. Bowdish, D.M. et al. (2005) A re-evaluation of the role of host defence peptides in mammalian immunity. Curr. Protein Pept. Sci. 6, 35−51
• 40. Lau, Y.E. et al. (2005) Interaction and cellular localization of the human host defense peptide LL-37 with lung epithelial cells. Infect. Immun. 73, 583−591 41
• 41. Mookherjee, N. et al., Intracellular receptor for human host defence peptide LL-37 in monocytes. J. Immunol. (in press) DOI:10.4049/ jimmunol.802 586, Epub ahead of print PMFD 19 605 696
• 42. Travis, S. et al. (2005) RDP58 is a novel and potentially effective oral therapy for ulcerative colitis. Inflamm. Bowel Dis. 11, 713−719
• 43. Holtmann, M.M. (2003) RDP-58 (SangStat Medical). IDrugs 6, 1188−1194
• 44. Xavier, R.J. and Podolsky, D.K. (2007) Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature 448, 427−434
• 45. Giacometti, A. et al. (2003) Antiendotoxin activity of protegrin analog IB-367 alone or in combination with piperacillin in different animal models of septic shock. Peptides 24, 1747−1752
• 46. Sokolova, G.B. et al. (2002) [Glutoxim in the complex treatment of tuberculosis]. Antibiot. Khimioter. 47, 20−23 (English translation available at http://www.glutoxim.ru/eng/index.php?id=9&issueId=2)
• 47. Fimiani, V. et al. (2002) Immunomodulatory effect ofglutoxim on some activities of isolated human neutrophils and in whole blood. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 24, 627−638
• 48. 48 Fischer, P.M. (2003) The design, synthesis and application of stereochemical and directional peptide isomers: a critical review. Curr. Protein Pept. Sci. 4, 339−356
• 49. Kraus, D. and Peschel, A. (2008) Staphylococcus aureus evasion of innate antimicrobial defense. Future Microbiol. 3, 437−451
• 50. Andra, J. et al. (2006) Mechanisms of endotoxin neutralization by synthetic cationic compounds. J. Endotoxin Res. 12, 261−277
• 51. Lynn, D.J. et al. (2008) InnateDB: facilitating systems-level analyses of the mammalian innate immune response. Mol. Syst. Biol. 4, 218
• 52. Mookherjee, N. et al. (2009) Systems biology evaluation of immune responses induced by human host defence peptide LL-37 in mononuclear cells. Mol. Biosyst. 5, 483−496
• 53. Nguyen, T.X. et al. (2003) Evolution of primate theta-defensins: a serpentine path to a sweet tooth. Peptides 24, 1647−1654
• 54. Carretero, M. et al. (2008) In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J. Invest. Dermatol. 128, 223 236
• 55. Steinstraesser, L. et al. (2008) Host defense peptides in wound healing. Mol. Med. 14, 528−537
• 56. 56 Weber, G. et al. (2009) Human antimicrobial protein hCAP18/LL-37 promotes a metastatic phenotype in breast cancer. Breast Cancer Res. 11, R6
• 57. Coffelt, S.B. et al. (2009) The pro-inflammatory peptide LL-37 promotes ovarian tumor progression through recruitment of multipotent mesenchymal stromal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 38 063 811
• 58. Lingnau, K. et al. (2002) Poly-L-arginine synergizes with oligodeoxynucleotides containing CpG-motifs (CpG-ODN) for enhanced and prolonged immune responses and prevents the CpG-ODN-induced systemic release of pro-inflammatory cytokines. Vaccine 20, 3498−3508
• 59. 59 Schellack, C. et al. (2006) IC31, a novel adjuvant signaling via TLR9, induces potent cellular and humoral immune responses. Vaccine 24, 5461−5472
• 60. 60 Stevceva, L. and Ferrari, M.G. (2005) Mucosal adjuvants. Curr. Pharm. Des. 11, 801−811
• 61. Soehnlein, O. et al. (2008) Neutrophil secretion products pave the way for inflammatory monocytes. Blood 112, 1461−1471
• 62. Elssner, A. et al. (2004) A novel P2X7 receptor activator, the human cathelicidin-derived peptide LL37, induces IL-1| processing and
• 63. release. J. Immunol. 172, 4987−4994
• 64. 63 Barlow, P.G. et al. (2006) The human cationic host defense peptide LL-37 mediates contrasting effects on apoptotic pathways in different primary cells of the innate immune system. J. Leukoc. Biol. 80, 509−520
• 65. 64 Zheng, Y. et al. (2007) Cathelicidin LL-37 induces the generation of reactive oxygen species and release of human a-defensins from neutrophils. Br. J. Dermatol. 157, 1124−1131
• 66. 65 Di Nardo, A. et al. (2003) Cutting edge: mast cell antimicrobial activity is mediated by expression of cathelicidin antimicrobial peptide. J. Immunol. 170, 2274−2278
• 67. 66 Niyonsaba, F. et al. (2001) Evaluation of the effects of peptide antibiotics human |-defensins-1/-2 and LL-37 on histamine release and prostaglandin D2 production from mast cells. Eur. J. Immunol. 31, 1066−1075
• 68. Davidson, D.J. et al. (2004) The cationic antimicrobial peptide LL-37 modulates dendritic cell differentiation and dendritic cell-induced T cell polarization. J. Immunol. 172, 1146−1156
• 69. Kandler, K. et al. (2006) The anti-microbial peptide LL-37 inhibits the activation of dendritic cells by TLR ligands. Int. Immunol. 18,1729−1736
• 70. Biragyn, A. et al. (2002) Toll-like receptor 4-dependent activation of dendritic cells by |-defensin 2. Science 298, 1025−1029
• 71. Lande, R. et al. (2007) Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. Nature 449, 564−569
• 72. Yamasaki, K. et al. (2007) Increased serine protease activity and cathelicidin promotes skin inflammation in rosacea. Nat. Med. 13, 975−980
• 73. Tokumaru, S. et al. (2005) Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J. Immunol. 175, 4662−4668
• 74. Tjabringa, G.S. et al. (2003) The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J. Immunol. 171, 6690−6696
• 75. 74 Pistolic, J. et al. (2008) Host defence peptide LL-37 induces IL-6 expression in human bronchial epithelial cells by activation of the NF-kB pathway. J. Innate Immun. 1, 254−267
• 76. Otte, J.M. et al. (2009) Effects of the cathelicidin LL-37 on intestinal epithelial barrier integrity. Regul. Pept. 156, 104−117
• 77. Wehkamp, J. et al. (2007) Defensins and cathelicidins in gastrointestinal infections. Curr. Opin. Gastroenterol. 23, 32−38
• 78. Koczulla, R. et al. (2003) An angiogenic role for the human peptide antibiotic LL-37/hCAP-18. J. Clin. Invest. 111, 1665−1672
• 79. 78 von Haussen, J. et al. (2008) The host defence peptide LL-37/hCAP-18 is a growth factor for lung cancer cells. Lung Cancer 59, 12−23
• 80. 79 Chuang, C.M. et al. (2009) Treatment with LL-37 peptide enhances antitumor effects induced by CpG oligodeoxynucleotides against ovarian cancer. Hum. Gene Ther. 20, 303−313
• 81. 80 van den Berg, H.R. et al. (2009) Synthetic oligopeptides related to the b-subunit of human chorionic gonadotropin attenuate inflammation and liver damage after (trauma) hemorrhagic shock and resuscitation. Shock 31, 285−291