Экспериментальная часть. 
Разработка и создание нового галенового препарата (на примере водно-спиртового извлечения из лекарственного сбора "Арфазетин")

Объектом изучения служил сбор «Арфазетин», производитель ОАО «Красногорсклексредства», серия 10 112.

В качестве экстрагента при получении извлечения использовался спирт этиловый 70%.

Аппаратура, используемая в работе.

• 1. перколятор
• 2. аналитические весы
• 3. весы ручные
• 4. сушильный шкаф
• 5. центрифуга
• 6. спиртомер бытовой ДИАС

Задачами для выполнения работы было создание новой лекарственной формы (водно-спиртовое извлечение из сбора «Арфазетин»), ее качественный и количественный анализ, проведение испытаний согласно общей фармакопейной статье ГФ XI издания «Настойки», а также сравнительный анализ содержания действующих веществ в полученном водно-спиртовом извлечении и водном извлечении, изготовленном согласно инструкции к медицинскому применению сбора.

Методика получения настойки Для получения настойки использовали:

• 1. Лекарственный растительный сбор «Арфазетин»
• 2. Экстрагент — спирт этиловый 96%, разведенный до концентрации 70% согласно ГФ XI.

Разведение спирта производилось согласно таблице, указывающей в целых числах весовые (в граммах) количества воды и спирта различной крепости, которые необходимо смешать, чтобы получить 1 кг спирта крепостью 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 92% ГФ XI издания.

Спирт этиловый 96% - 665,0 г Вода очищенная — 335,0 г Таким образом, для приготовления 200 мл 70% спирта этилового необходимо взять: 133,0 г спирта этилового 96% и 67,0 г воды очищенной.

Для получения водно-спиртового извлечения использовали соотношение сырье: экстрагент — 1:10.

Получение настойки осуществляли методом перколяции в 3 стадии:

I стадия — намачивание сырья. 20,0 г сбора «Арфазетин», поместили в емкость для намачивания, залили 200 мл спирта этилового 70% и оставили на 4−5 часов, предварительно закрыв ёмкость. За этот период осуществляется капиллярная пропитка сырья, происходит образование концентрированного внутриклеточного сока (первичного сока).

II стадия — мацерационная пауза (настаивание). Набухший материал загрузили в мешок из фильтрующего материала, поместили в перколятор на ложное дно с оптимальной плотностью, чтобы в сырье оставалось как можно меньше воздуха; наверх положили груз, чтобы максимально вытеснить воздух, затем сырье залили экстрагентом до образования «зеркала», высота слоя над сырьем получилась равной 30 мм. Настаивание осуществляли в течение 48 часов для наиболее полного извлечения действующих веществ. На этой стадии происходит выход экстрактивных веществ в экстрагент, образуется пограничный слой.

III стадия — перколация. Осуществили процеживание экстрагента через слой сырья.

Очистку полученного нового извлечения производили отстаиванием при температуре 80C в течение 24 часов до получения прозрачной жидкости, осадок (5 мл) сливали. Объём извлечения на выходе получился 170 мл.

Общие испытания проводили согласно общей фармакопейной статье ГФ XI издания «Настойки».

• 1. Проверку органолептических признаков проводили визуальным методом — оценивали вкус, цвет и запах извлечения. В результате испытания обнаружили — вкус специфический горьковато-сладкий, соответствующий компонентам, входящим в состав сбора, цвет красновато-коричневый, запах характерный, резкий, ароматный.
• 2. Количественное определение спирта проводили, используя спиртомер (ALCOHOLOMETER) бытовой ДИАС 0 — 96% об., по следующей методике: во флакон 100 мл с исследуемым извлечением, наполненным на 2/3, плавно опускали спиртомер таким образом, чтобы прибор не касался стенок и дна флакона. После того как спиртометр установился в стационарном положении, наблюдали по шкале содержание спирта в исследуемом водно-спиртовом извлечении по линии совмещения нижнего мениска жидкости с делением шкалы. В результате эксперимента установили, что концентрация спирта этилового составила 67%.
• 3. Содержание экстрактивных веществ (сухого остатка) определяли по методике ГФ XI: 5 мл настойки поместили во взвешенный бюкс высотой 2−3 см и диаметром 5−7 см, выпарили на водяной бане, затем высушили в сушильном шкафу при температуре 100−1050С в течение 3 часов до постоянной массы.

В результате эксперимента удалось определить, что содержание сухого остатка в извлечении: составляет 0,2624±0,252 г.

4. Содержание тяжелых металлов определяли по методике: к 10 мл извлечения прибавляли 1 мл разведенной уксусной кислоты, 2 капли раствора сульфида натрия, перемешали и через 1 минуту сравнили с эталоном, состоящим из 10 мл 0,5% раствора ацетата свинца и такого же количества реактивов, какое добавлено к испытуемому раствору. Наблюдение окраски производили по оси пробирок диаметром около 1,5 см, помещенных на белой поверхности. Окраска, появившаяся в испытуемом растворе, не превышала эталон, была заметна лишь слабая опалесценция от серы, выделяющейся из сульфида натрия.

Качественный анализ действующих веществ проводили по следующим методикам:

• 1) Обнаружение дубильных веществ согласно ГФ XI издания: к 2 мл извлечения добавляли несколько капель раствора железоаммониевых квасцов, результатом эксперимента явилось черно-зеленое окрашивание раствора.
• 2) Обнаружение органических кислот также проводили согласно методикам в ГФ XI издания:

Щавелевая кислота: к 2 мл извлечения добавили 4 капли раствора кальция сульфата насыщенного, в результате образовался осадок растворимый в соляной кислоте и не растворимый в уксусной кислоте.

Янтарная кислота: к 1 мл извлечения добавили несколько кристалликов резорцина, затем по стенке пробирки добавили 0,5 мл концентрированной серной кислоты, охладили и добавили 0,5 мл 10% раствора гидроксида аммония, зеленая флуоресценция не появилась.

Лимонная кислота: 1 мл извлечения помещали в выпарительную чашку, добавляли несколько кристалликов ванилина и выпаривали досуха. К остатку добавляли 2 капли концентрированной серной кислоты, нагревали на водяной бане, в результате реакции появилось фиолетовое окрашивание.

Яблочная кислота: к 2 мл извлечения добавили 0,1 мл в-нафтола и 1каплю концентрированной серной кислоты. Опустили пробирку на ½ мин в кипящую водяную баню, в результате реакции наблюдалась ярко-желтая с зеленым флуоресценция.

Винная кислота: 4 капли извлечения выпаривали досуха в фарфоровой чашке, добавляли 1 мл концентрированной серной кислоты и несколькими кристалликами резорцина, нагревали на водяной бане, в результате реакции вишнево-красное окрашивание не появилось.

• 3) Качественное обнаружение полисахаридов проводили согласно методике (ГФ XI): К 10 мл извлечения прибавляли 30 мл 95% спирта и перемешивали; появились хлопьевидные сгустки, выпавшие в осадок при стоянии. Затем часть осадка переносили в пробирку, прибавляли 2 мл разведенной хлористоводородной кислоты, нагревали на водяной бане, затем прибавляли 10 мл реактива Фелинга и снова нагревали. В результате реакции образовался оранжево-красный осадок.
• 4) Качественное обнаружение флавоноидов проводили согласно ГФ XI издания:
• 1. общей реакцией на флавоноидные соединения является цианидиновая проба — 10 мл извлечения выпаривали до объема 2 мл, прибавляли 3 капли концентрированной хлористоводородной кислоты, затем добавляли 0,05 г цинковой пыли и нагревали на водяной бане до кипения. В результате реакции жидкость приобрела красный цвет.
• 2. взаимодействие со щелочами: к 10 мл извлечения добавляли 2 мл NaOH, наблюдалось желтое окрашивание.

Количественное определение извлечения проводили на органические кислоты, дубильные вещества, полисахариды и флавоноиды в соответствии с методиками, регламентированными ГФ XI (выпуск 2).

1) Содержание органических кислот определяли методом алкалиметрии по методике: 5 мл извлечения помещали в колбу на 500 мл, прибавляли 200 мл воды очищенной, 1 мл 1% спиртового раствора фенолфталеина, 2 мл 0,1% метиленового синего и титровали 0,1 моль/л натрия гидроксидом до появления лилово-красной окраски.

Содержание свободных органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в процентах вычисляли по формуле (1):

(1).

0,0067 — титр;

V — объем титранта, мл;

К — коэффициент пересчета;

Х — процентное содержание органических кислот.

Получили следующие данные: Vср = 3,47 мл Процентное содержание органических кислот в водно-спиртовом извлечении составило 0,4649 ± 0,2 498%.

2) Содержание дубильных веществ определяли методом перманганатометрии по методике:25 мл извлечения помещали в колбу на 1 л., прибавляли 500 мл воды очищенной, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титровали при постоянном перемешивании 0,02 моль/л раствором калия перманганата до золотисто-желтого окрашивания.

Содержание дубильных веществ в пересчете на танин вычисляли по формуле (2):

(2).

Х — процентное содержание дубильных веществ;

V1 — объем титранта.

V2 — объем, пошедший на титрование в контрольном опыте.

0,4 157- титр

Kкоэффициент пересчета В результате эксперимента были получены следующие данные:

V1=8,23 мл; V2 =2,12 мл Процентное содержание дубильных веществ в водно-спиртовом извлечении составило 1,306 ± 0,225%.

3) Содержание полисахаридов определяли по методике: 25 мл извлечения помещали в центрифужную пробирку, прибавляли 75 мл 95% спирта, перемешивали, подогревали на водяной бане до 300С в течение 5 минут. Через час содержимое центрифугировали с частотой вращения 5000 об/мин в течение 30 минут. Осадок количественно перенесли на фильтр и последовательно промывали 15 мл раствора 95% спирта в воде (3:1), 10 мл ацетона, 10 мл этилацетата. Фильтр с осадком высушивали сначала на воздухе, затем при температуре 100−1050Сдо постоянной массы.

Содержание полисахаридов в процентах (Х) вычисляли по формуле (3):

(3).

m1- масса фильтра в граммах;

m2- масса фильтра с осадком в граммах;

Vобъем извлечения В результате исследования были получены следующие данные:

m (1)=1,0289 г, m (2)=2,3807 г.

Процентное содержание полисахаридов в водно-спиртовом извлечении составило 5,4072 ± 0,411%.

4) Содержание флавоноидов определяли методом спектрофотометрии по методике: 2 мл извлечения помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 2 мл 5% раствора алюминия хлорида, 6 капель кислоты хлористоводородной разведенной, доводили объем раствора до метки 95% спиртом этиловым и перемешивали. Через 45 минут измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали смесь, состоящую из 2 мл извлечения, 6 капель кислоты хлористоводородной разведенной и доведенной 95% этанолом в мерной колбе до 25 мл. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора РСО рутина в 95% спирте этиловом.

Приготовление раствора РСО рутина: около 0,025 г (точная навеска) рутина, предварительно высушенного при температуре 130−1350С в течение 3-х часов, растворяли в мерной колбе вместимостью 50 мл в 95% спирте этиловом. 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли 1 мл 5% раствора алюминия хлорида и 6 капель кислоты хлористоводородной разведенной и доводили до метки 95% спиртом этиловым.

Содержание суммы флавоноидов (Х) в пересчете на рутин определяли по формуле (4):

(4).

где D — оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 — оптическая плотность раствора РСО рутина;

V — объем извлечения, мл;

m — навеска РСО рутина, г;

(рутина)=0,0257 г.

D0 = 0,402.

D = 1,124.

В результате исследования установили, что содержание флавоноидов в анализируемом извлечении в пересчете на рутин составило 1,7964±0,145%.

Количественное содержание всех действующих веществ в полученном водно-спиртовом извлечении представлено на рисунке 2.

Рисунок 2 — Количественное содержание действующих веществ в полученном водно-спиртовом извлечении.

Для проведения сравнительного анализа содержания действующих веществ в настойке, использовали данные количественного содержания органических кислот (0,084%), дубильных веществ (0,285%) и полисахаридов (1,966%) в водном извлечении, изготовленном согласно инструкции к медицинскому применению сбора «Арфазетин», полученные ранее при выполнении дипломной работы Куликовой С. И. на кафедре УЭФ Тверской ГМА в 2011 году.

В результате сравнительного анализа содержания органических кислот было установлено, что в водно-спиртовом извлечении их процентное содержание составило 0,4649±0,2 498%, что в 5,5 раза больше, чем в водном извлечении (0,084%) (рисунок 3).

Рисунок 3 — Сравнительная характеристика количественного содержания органических кислот в полученном водно-спиртовом извлечении и водном извлечении, изготовленном согласно инструкции к медицинскому применению сбора.

В результате количественного анализа дубильных веществ было установлено, что в водно-спиртовом извлечении их процентное содержание составило 1,306±0,225%, что в 4,6 раза больше, чем в водном извлечении (0,285%) (рисунок 4).

Рисунок 4 — Сравнительная характеристика количественного содержания дубильных веществ в полученном водно-спиртовом извлечении и водном извлечении, изготовленном согласно инструкции к медицинскому применению сбора.

Рисунок 5 — Сравнительная характеристика количественного содержания органических кислот в полученном водно-спиртовом извлечении и водном извлечении, изготовленном согласно инструкции к медицинскому применению сбора.