Исследования крови, лимфы и синовиальной жидкости методом электретно-термического анализа

Метод электретно-термического анализа разработан в физике диэлектриков для того, чтобы оценивать распределение в веществе носителей зарядов и регистрировать в нем отличный от нуля суммарный электрический момент. Его применение для изучения поляризационного заряда, образующегося в диэлектрике при электрической обработке, во многих странах регламентировано стандартами. Сущность метода состоит в регистрации тока, возникающего в образце вследствие стимулированных нагреванием разупорядочения диполей, высвобождения носителей заряда из ловушек и их движения. В последние годы электретно-термический анализ все чаще используется для изучения биологических и медицинских объектов, таких как коллаген, гемоглобин, полисахариды и др. Объектами таких исследований традиционно являются вещества в твердой фазе. Например, гидратированное состояние клеток крови изучают на замороженных пробах крови при отрицательных температурах.

Предпринята попытка применить метод электретно-термического анализа для исследования биологических жидкостей, прежде всего, крови и СЖ. Выбор крови в качестве объекта исследования обусловлен тем, что, во-первых, СЖ и плазма крови близки по клеточному составу, а во-вторых, анализ крови является обязательным при диагностике любых заболеваний, т.к. кровь несет информацию о состоянии всех систем организма.

Кровь представляет собой динамически сбалансированную многокомпонентную систему, важной характеристикой которой являются ее структурные параметры. Об этом свидетельствует следующее. Эффективность кровообращения определяется, с одной стороны, формой и протяженностью участков капиллярной кровеносной системы, а с другой — размерными параметрами клеток крови, их способности к деформации, агрегатированию и осаждению на стенках капилляров. Тяжесть протекания ишемической болезни сердца зависит от несостоятельности коронарного русла, которая связана с патологией эритроцитов и резким увеличением их агрегационной способности, обусловливающей повышение вязкости плазмы и крови. Существуют убедительные подтверждения метаболических изменений клеток крови при ишемии, вызванных трансформацией их поверхностного заряда, формы и объема. Чувствительность клеток крови к воздействию электрического поля подтверждена обнаружением их электрофоретической подвижности, а также способностью клеток удерживать поляризационный заряд. Тем не менее, патологические изменения крови не входят в число признаков, по которым классифицируют функциональное состояние больных ишемической болезнью сердца, а принятые в клинической кардиологии методики исследования частиц крови не позволяют оценить структурные параметры последних.

В экспериментах используют периферическую кровь I-IV групп с положительным резус-фактором. Пробу крови помещают на алюминиевый электрод, предварительно промытый этиловым спиртом. Затем электрод накрывают полимерной (ПТФЭ) пленкой толщиной 100 мкм, на которую накладывали второй электрод, и немедленно устанавливают полученный образец в прибор для термостимулированной деполяризации. Кровь не успевает коагулировать за короткое время приготовления образца (10−15 с), поэтому мы не используют антикоагулянты. Проба крови, помещенная в замкнутое пространство между электродом и ПТФЭ-пленкой не могла высохнуть во время эксперимента и при Т<100 ^оС подвергалась термостимулированной деполяризации в жидкой фазе.

В другом эксперименте пробу крови высушивали при комнатной температуре на нижнем электроде, и, не накладывая ПТФЭ-пленку, накрывали верхним электродом.

Регистрируют ток, который возникает в цепи, замыкающей электроды, при нагревании образцов со скоростью 5 ^оС/мин. Схема измерительной ячейки приведена на рис 1. Зависимость тока I от температуры Т представляет собой спектр термостимулированных токов (ТСТ), который несет информацию о механизмах, ответственных за возникновение тока. Контрольные эксперименты показали, что ПТФЭ-пленка не имеет поляризационного заряда: при ее термодеполяризации в исследованном диапазоне температур 20−150 ^оС ТСТ не регистрируются. Для точного определения энергий активации процессов релаксации поляризационного заряда соответствующих пикам на спектрах ТСТ, используют метод термоочистки. Образец нагревали с постоянной скоростью, прописывая первый пик, а затем быстро охлаждают до комнатной температуры. После повторного нагревания регистрировали следующий пик при более высокой температуре и т. д. Методом Гарлика-Гибсона — по начальному участку подъема кривой I (Т) к максимуму — определяют энергию активации, соответствующую исследуемому пику.

Приведенные ниже результаты представляют собой средние значения не менее чем пяти измерений, проведенных для каждой группы крови в идентичных условиях с использованием проб, взятых у разных пациентов.

Эксперименты обнаружили удивительный феномен: при нагревании проб крови, не подвергавшихся никакой электрической обработке, возникают спектры термостимулированных токов. Это можно объяснить следующим образом. Кровь представляет собой многокомпонентную систему, состоящую из плазмы (водный раствор минеральных солей, аминокислот, белков, ферментов, стероидных соединений — в том числе, жидкокристаллических производных холестерина и др.), в которой взвешены клетки крови — эритроциты, лейкоциты, тромбоциты. Наличие солей позволяет предполагать присутствие в жидкой крови некоторого количества свободных носителей заряда. В химической структуре органических соединений плазмы и липидных оболочек клеток крови имеется множество полярных групп (NH, СО, ОН и др.), что при определенных условиях может придавать компонентам крови ярко выраженный дипольный характер. Кроме того, в крови присутствуют соединения, имеющие свойства жидких кристаллов (производные холестерина, некоторые белки и др.). Разделение зарядов и ориентация диполей в жидких пробах происходят из-за различий в работе выхода электродов, крови и ПТФЭ-пленки. Нагревание этой системы сопровождается разупорядочением пространственных зарядовых и дипольных структур крови. При идентификации спектров ТСТ простейших биополимеров — коллагена и желатина — появление низкотемпературного пика обычно связывают с разориентацией диполей, а высокотемпературных — с релаксацией пространственного заряда.

Все исследованные пробы крови имеют три главных пика на спектрах ТСТ (рис. 2).

Низкотемпературный пологий пик релаксации отрицательного заряда соответствует Т=30−50 ^оС. Его появление можно объяснить следующим образом. Входящие в состав компонентов крови полярные группы обусловливают гидрофильность компонентов и наличие вокруг большинства из них гидратных оболочек. Связанное (структурированное) состояние части воды в крови, которое возникает при образовании водородных связей с полярными фрагментами органических молекул, может порождать электретный эффект. Наличие на спектре ТСТ участков, отвечающих связанной воде в биополимерах, показано в работах. По-видимому, низкотемпературный пик на спектре ТСТ крови отвечает термически стимулированному разрушению координационных структур, содержащих связанную воду. Энергия активации процесса релаксации заряда, соответствующего этому пику, составляет W₁ = 0,45 эВ. Средняя величина энергии водородной связи колеблется в пределах от 0,10 до 0,25 эВ. При наличии в крови органических соединений со сложной пространственной конфигурацией, содержащих полярные группы, можно предполагать связывание молекул воды в координационные структуры с большими энергиями связей. По-видимому, свой вклад в низкотемпературный пик вносит высвобождение зарядов, сопровождающее перестройку структуры термотропных жидких кристаллов на основе содержащихся в крови производных холестерина.

Рис. 2 Спектры термостимулированных токов крови человека разных групп: а — I, б и в — II, г и д — III с высокотемпературными пиками разной полярности, е — IV, ж — кровь (II), высушенная на электроде

Среднетемпературный пик (Т=70−90 ^оС) интенсивнее первого и, как правило, представляет собой комбинацию нескольких пиков. Это свидетельствует о том, что в указанном диапазоне температур деполяризации происходит разрушение нескольких координационных структур. На наш взгляд, этот пик отвечает тепловой денатурации белковых соединений крови, т. е. необратимому изменению третичной структуры белка, не сопровождающемуся разрывом полипептидной цепи. Известно, что пространственная структура белка стабильна, если в белковой глобуле сохранилось не менее 90% внутримолекулярных водородных связей. По-видимому, при 70−90 ^оС происходит разрушение большого количества связей, что вызывает кооперативный переход белковых структур в денатурированное состояние. Вклад в денатурацию белковых соединений крови вносит тепловая релаксация зарядов ионизированных и протонированных групп, ответственных за электростатическое притяжение фрагментов белковой молекулы, а также ван-дер-ваальсовых взаимодействий, которые обусловлены притяжением постоянных, наведенных или виртуальных диполей. Волнистый профиль среднетемпературного пика на рис. (б), подтвержденный термоочисткой (в), соответствует трем энергиям связей (в диапазоне W₂ = 0,5−0,7 эВ) ответственных за поляризацию белковых структур крови II группы.

Самый интенсивный высокотемпературный пик отвечает Т = 105−120 ^оС, при которой в крови происходит фазовый переход, соответствующий формированию твердой пленки спекшейся крови. Термоокислительная деструкция органических соединений крови сопровождается слипанием липидных оболочек эритроцитов, денатурированных белков, фрагментов полипептидных цепей и т. п. Термораспад вновь образованных структур обусловливает релаксацию объемного поляризационного заряда, существенный вклад в формирование которого вносит, по-видимому, поляризация Максвелла-Вагнера.

Спектр ТСТ крови, высушенной на электроде, (ж) снят в образце, не содержащем ПТФЭ-пленку. Обращает на себя внимание значительное увеличение интенсивности всех трех пиков. Это может быть связано с тем, что при высыхании на воздухе связанная вода не только остается в структуре крови, но ее связи с комплексообразователями становятся более интенсивными. Кроме того, происходит окисление органических компонентов крови, что должно вносить вклад в их дипольные моменты.

При схожем характере спектров ТСТ разных групп крови (рис. а-е) обращает на себя внимание неодинаковое положение высокотемпературных пиков на шкале Т, отличия в их интенсивности и полярности. Максимум высокотемпературного пика сдвигается в область низких температур с увеличением номера группы крови: 115−118 ^оС (I группа), 108−110 ^оС (II), 98−100 ^оС (III), 95−97 ^оС (IV). Отмечено не поддающееся пока однозначной интерпретации изменение полярности высокотемпературного пика на спектрах ТСТ проб крови, взятых в течение дня у одного и того же донора (рис. г, д). Отмеченные эффекты, по-видимому, связаны с определенными жизненными циклами организма человека. Обратимые биохимические процессы протекают в крови с образованием положительных и отрицательных потенциалов в двойном электрическом слое, окружающем клетки крови. В зависимости от физиологических факторов (кровяное давление, физическая активность, наличие в организме стимуляторов и т. п.) можно ожидать колебания в распределении этих потенциалов, приводящего к изменению интенсивности и полярности пиков ТСТ.

Синовиальная жидкость, в силу своего происхождения из плазмы крови, имеет сходную с ней основу и содержит воду, липиды, протеины, мочевину и другие биологические жидкости. Однако своими псевдоупругими свойствами СЖ обязана высокому содержанию ГУК и гиалуронатов, а необычными смазочными характеристиками — производным эфиров холестерина, которые являются термотропными жидкокристаллическими соединениями. Такая система должна иметь специфические электрофизические свойства, которые определяют ее чувствительность к действию биопотенциалов и механизмы смазывания сустава.

На рис. 3 приведен спектр ТСТ синовии, взятой из коленного сустава пациента, больного артритом (начальная стадия).

Рис. 3 Спектры ТСТ синовии: 1 — исходный, 2 — после трения в паре СВМПЭ — CoCrMо

По-видимому, пик положительных токов при 28−31 ^оС на спектре исходной СЖ соответствует тепловому разрушению дипольной упорядоченной структуры мезофазы СЖ. При этих же температурах начинается разрушение гидратных оболочек биополимеров, что также вносит свой вклад в форму и размеры пика.

Пик отрицательных токов при 65 ^оС сравним по интенсивности с низкотемпературным пиком и обусловлен разрывом координационных связей в сложной пространственной структуре белково-полисахаридного комплекса СЖ. Трение обусловливает деструкцию тех и других структур о чем свидетельствует уменьшение обоих пиков ТСТ при анализе пробы СЖ, взятой из зоны трения маятникового трибометра после 2 ч. его работы (р = 2 МПа, v = 0,1 м/с). Видно, что в наибольшей мере повреждены белково-полисахаридные координационные соединения, в то время как специфическая послойная структура жидкокристаллических компонентов СЖ хоть и претерпела трибохимические изменения, но в значительной мере сохранилась.

На основе результатов исследования температурных превращений СЖ, составлена схема фазовых переходов СЖ (рис. 4). Она согласуется со спектрами ТСТ, представленными на рис. 3.

Рис. 4 Схема температурных переходов в СЖ

Приведенные результаты свидетельствуют, что кровь и СЖ проявляют спонтанный «квази-электретный» эффект, обусловленный координационным характером связей их надмолекулярной структуры. Параметры этого эффекта in vivo зависят от природы биофизических и биохимических процессов, протекающих в организме человека. Это дает основания для моделирования СЖ как трехмерного молекулярного комплекса, который образован структурно координированными и функционально взаимосвязанными компонентами. Представляется, что структурные характеристики такого комплекса могут быть критерием при оценке функционального состояния СЖ, а метод электретно-термического анализа — несложным и достаточно информативным инструментом для диагностики заболеваний суставов. Малый (порядка 0,1 мл) объем проб СЖ, необходимых для анализа, позволяет отнести термодеполяризацию к совокупности методов микроанализа, переход к которым составляет современную тенденцию клинических лабораторных исследований.