Механизм работы и энергетика кальциевых каналов при стимуляции клеток

Транспортные АТФазы называют ионными насосами поскольку они переносят дискретные частицы — ионы. Каждый цикл переноса включает в себя как минимум три стадии: 1) частицу надо захватить с одной стороны мембраны, 2) перенести ее через мембрану (транслоцировать) и 3) выпустить с другой стороны. Осуществление этих стадий сопряжено с расходом энергии, и, следовательно, одновременно что-то должно происходить с АТФ. Сама молекула АТФ тоже должна быть захвачена (1) и гидролизована с запасанием энергии и расходом ее на перенос кальция (2), а продукты (АДФ и фосфат) должны перейти из связанного с ферментом состояния в водный раствор (3). В каждом цикле фермент одновременно использует не один, а два субстрата (внутриклеточный кальций и АТФ) и образует три продукта: кальций, накопленный внутри везикул эндоплазматического ретикулума, АДФ и ортофосфат. Усилиями многих ученых была в общих чертах расшифрована последовательность стадий при работе Ca-АТФазы, которая включает в себя все перечисленные выше этапы. Работа насоса замечательна еще и тем, что стадии переработки АТФ как бы чередуются со стадиями переноса Ca²⁺. Эти стадии перечислены ниже:

связывание двух ионов кальция на поверхности АТФазы, обращенной в цитоплазму (или наружу в изолированных пузырьках СР);

связывание на той же поверхности молекулы АТФ;

фосфорилирование белка (образование фосфофермента) и высвобождение АДФ; высвобождение ионов кальция с поверхности АТФазы, обращенной внутрь пузырьков СР; связывания магния;

гидролиз фосфатной связи и отщепление ионов магния;

Работа кальциевых насосов требует определённой энергии, которая выделяется в результате обратимой реакции гидролиза АТФ:

АТФ+Н₂О — ДG — АДФ+ Ф_Н^- +Н ⁺ (1).

Гидролиз АТФ осуществляется Са²⁺-АТФазой в три этапа. В начале происходит связывание АТФ, затем фосфорилирование белка и отщепление АДФ и, наконец, гидролитическое расщепление белок-фосфатной связи и высвобождение ортофосфата. Фосфорилирование осуществляется по карбоксильной группе остатка аспарагиновой кислоты.

Стадия эта обратима: добавив к изолированным везикулам эндоплазматического ретикулума, содержащим фермент-фосфат (Е~ Р), АДФ в присутствии 1 мМ Са ²⁺, можно наблюдать почти полный перенос фосфата с белка на АДФ с образованием АТФ. Таким образом, в мембранах СР существует равновесие:

К₀ K_ph

(2).

где К₀ — константа связывания ионов кальция на АТФазе у наружной поверхности мембранных везикул СР, а K_ph — константа равновесия реакции фосфорилирования. Последняя величина близка к единице.

Известно четыре основные системы активного транспорта ионов в клетке, три из которых обеспечивают перенос ионов К⁺, Са ²⁺ и Н⁺ через биологические мембраны за счет энергии гидролиза АТФ специальными ферментами-переносчиками, которые называются транспортными АТФ-азами).

Четвертый механизм — перенос протонов при работе дыхательной цепи митохондрий пока изучен недостаточно. Наиболее сложно из транспортных АТФ-аз устроена НАТФ-аза, состоящая из нескольких субъединиц, а самая простая — Са ²⁺ -АТФ-аза, состоящая из одной полипептидной цепи с молекулярной массой около 100 000.

Рассмотрим механизм переноса ионов кальция этой АТФ-азой.

Активный перенос ионов кальция через биомембрану Первый этап работы Ca ²⁺ — АТФ-азы — связывание субстратов: Са ²⁺ и АТФ в комплексе с Мg (Мg²±АТФ). Эти два лиганда присоединяются к разным центрам на поверхности молекулы фермента, обращенной наружу мембранного пузырька. Высокая константа связывания Ca²+ (порядка 10 ккал/моль) свидетельствует о том, что при связывании этого иона высвобождается большое количество энергии.

Для того чтобы перенести через мембрану 2 грамм-эквивалента ионов кальция из клеточного сока, где его концентрация C_i = 1 * 10⁷ М, во внутреннюю полость СР, где концентрация кальция близка к 1 мМ (C₀ = 1 * 10³М), требуется затратить энергию, равную:

(3).

где— изменение свободной энергии при переносе одного моля одновалентного иона (электрохимический потенциал), — изменение энергии за счет взаимодействия одного моля ионов с окружающей средой (химическое сродство), R— газовая постоянная, T— абсолютная температура, RTln (Ci/C₀) — изменение энергии моля ионов при изменении его концентрации, z— валентность иона, F— число Фарадея (заряд одного моля одновалентного иона), — разность электрических потенциалов на мембране, — изменение энергии моля ионов за счет перемещения в электрическом поле.

Поскольку внутри мембранных везикул СР потенциал равен внутриклеточному (= 0), а величина С₀ примерно одинакова для ионов кальция в водных растворах= 0), можно считать, что изменение свободной энергии при переносе двух молей равно при 37° С :

?G= 2RTln (Ci/ C₀) = 47,5 кДж/моль (4).

Это приблизительно равно энергии гидролиза макроэргической связи АТФ при физиологических концентрациях АТФ, АДФ и ортофосфата. Таким образом, транспорт кальция через мембрану саркоплазматического ретикулума осуществляется с высоким коэффициентом полезного действия, почти без потерь энергии. Помимо прочего это предполагает обратимость работы Ca²±АТФазы. И действительно, было показано, что можно получить синтез АТФ из АДФ и фосфата, если нагрузить изолированные везикулы СР кальцием, а затем убрать кальций из окружающей среды, добавив туда комплексон — соединение, связывающее Ca²⁺. Заметим, что обратимо могут работать также и другие транспортные АТФазы: Na/K-АТФаза цитоплазматических мембран и Н+ - АТФаза митохондрий [2,17].