Ростостимулирующая активность некоторых представителей рода bacillus филлоплана древесных растений г. Ставрополя

Plant growth promotion bacteria (PGPB) — ризосферные, эпифитные и эндофитные бактерии, благоприятно воздействующие на рост и развитие своих хозяев. Они используют сходные механизмы стимуляции роста растения-хозяина. PGPB влияют на развитие растений прямо или косвенно. Влияние, связанное с продукцией метаболитов, таких как антибиотики, токсины, гидролитические ферменты, сидерофоры, которые снижают развитие фитопатогенов, называют косвенным. Прямой эффект наблюдается в улучшении минерального питания растения, синтезе гормонов роста и витаминов ассоциативными бактериями. Синтезируя все важнейшие фитогормоны — ауксины (индолил-3-уксусная кислота), гибберелины, цитокинины, этилен, микроорганизмы оказывают положительное влияние на рост растения [3, 9, 10].

Некоторые микросимбионты являются представителями сразу нескольких экологических групп. К числу таких микроорганизмов относят представителей рода Bacillus в связи с тем, что эти бактерии являются доминирующими видами в ризосфере, во внутренних частях растений и по данным ряда исследователей, типичными обитателями эпифитной микрофлоры [1, 2, 4, 10]. Наиболее изученными являются ризосферные микроорганизмы. Представители рода Bacillus отличаются от других бактерий высокой выживаемостью во внешней среде и толерантностью к антропогенным воздействиям.

Этому способствует разнообразная биологическая активность бацилл, выраженная в продуцировании фитогормонов, антибиотиков, ферментов, токсинов и других метаболитов. Способность к спорообразованию, высокая приспособляемость к условиям внешней среды, в том числе и абиотическим, обуславливают конкурентоспособность бацилл в ризои филлосфере и в тканях растения-хозяина.

Эпифитные бациллы способны синтезировать индолил-3-уксусную кислоту, с синтезом которой связано накопление в растении триптофана-предшественника ИУК [9].

Обладая высокой физиологической активностью, они составляют значительную часть микрофлоры «здорового» растения, участвуют в стимуляции роста своих хозяев, улучшают их водное и минеральное снабжение, а также способствуют появлению у растительных партнеров устойчивости к фитопатогенам [3]. Перечисленные положительные свойства штаммов рода Bacillus позволяют рассматривать их в качестве перспективных объектов при разработке микробиологических препаратов.

Поэтому выделение и идентификация эпифитных аэробных спорообразующих бактерий филлосферы древесных растений г. Ставрополя для тестирования на ростостимулирующие свойства представляется актуальным.

Цель исследования: выделение, идентификация и поиск перспективных штаммов эпифитных микроорганизмов в условиях города Ставрополя.

Задачи исследования:

• — выделить штаммы эпифитных микроорганизмов рода Bacillus с листовой пластинки исследуемых растений методом отпечатка;
• — идентифицировать штаммы аэробных спорообразующих бактерий, выделенных с филлоплана некоторых древесных растений г. Ставрополя;
• — изучить ростостимулирующие свойства некоторых штаммов эпифитных микроорганизмов.

Объектами исследования послужили микроорганизмы, выделенные с листовых пластинок древесных растений: Quercus robur L. (Дуб черешчатый), Carpinus caucasica Grossh. (Граб кавказский), Fraxinus excelsior L. (Ясень обыкновенный), Acer campestre L. (Клен полевой).

Выделение эпифитов производили методом отпечатка с поверхности филлоплана. Культивирование бациллярной флоры проводили при t=28±2єС, 35±2єС, 42±2єС, в течение 24−48 часов в аэробных условиях на питательных средах: МПА, Питательная среда для культивирования эпифитной микрофлоры (Патент № 2 366 701, Заикина И. А., Мануйлов И. М.).

При описании и идентификации бактерий изучали следующие параметры: культуральные и тинкториальные свойства, морфологические характеристики, физиолого-биохимические свойства.

Идентификация микроорганизмов проводилась в ФГБУ «Ставропольская межобластная ветеринарная лаборатория» классическими и инструментальными методами (Экспертиза № 8218−8277 от 28.05.2012), а также руководствуясь методическими рекомендациями [5, 6, 7, 8].

Применяли стерилизацию семян 96%-м этанолом в течении 5 мин. После стерилизации семена отмывали от 3 до 5 раз стерильной дистиллированной водой [5].

В качестве модельного объекта исследования фитостимулирующей активности представителей рода Bacillus были использованы семена пшеницы Triticum aestivum L. Бактеризацию проводили с помощью суспензии бактерий в концентрации 106 кл/мл. Зерна раскладывали в чашки Петри (20 зерен в каждую чашку) на слой фильтровальной бумаги, смоченной 10 мл культуральной жидкости и оставляли в термостате на 3 суток при 28єС.

О наличии или отсутствии фитостимулирующей способности штаммов бацилл судили при сравнении длины надземной части и длины корней проростков, обработанных соответствующим разведением в опытном и контрольном вариантах.

C поверхностей листовых пластинок древесных растений были выделены эпифиты, идентифицированные как аэробные спорообразующие бактерии, принадлежащие к 5 видам: Bacillus subtilis, Bac. megaterium, Bac. pumilis, Bac. cereus, Bac. licheniformis.

Всего было протестировано 43 штамма эпифитов, из них — 19 штаммов — Bacillus subtilis, 14 штаммов — Bacillus pumilis, 6 штаммов — Bacillus licheniformis и по 2 штамма — Bacillus megaterium и Bacillus cereus.

Данные по опыту представлены в таблице 1.

Таблица 1 — Ростостимулирующая активность эпифитных представителей рода Bacillus в отношении семян пшеницы (на 3 сутки).

микроорганизм древесный аэробный растение Фитостимулирующая активность эпифитных представителей рода Bacillus.

Из представленных в таблице данных видно, что только семь штаммов Bacillus subtilis (№ 13, 40, 50, 55, 60, 73, 79) проявляли фитостимулирующее действие. Показатели активности остальных культур были ниже контроля. В отношении подземной части семян пшеницы проявляли фитостимулирующее действие 14 штаммов Bacillus subtilis. Штаммы № 21, 41, 46, 49, 52, 59, 63, 66 не обладают данными свойствами в отношении подземной части семян пшеницы.

В отношении надземной части семян пшеницы семь штаммов Bacillus pumilis (№ 10, 43, 44, 48, 57, 70−1) проявляли фитостимулирующее действие. Показатели активности остальных культур оказались ниже контроля. Ростостимулирующая активность эпифитных Bacillus pumilis в отношении подземной и надземной части семян пшеницы сильно отличается. Только два штамма (№ 44, 70−1) обладают изучаемыми свойствами.

Анализируя результаты эксперимента видно, что пять штаммов Bacillus licheniformis (№ 8, 22, 31, 62, 67) оказывали положительное влияние на рост надземной части семян пшеницы. Показатель активности штамма № 47 значительно отличался от контроля. Фитостимулирующая активность Bacillus licheniformis в отношении подземной и надземной части семян пшеницы не одинакова, т. е. только три штамма (№ 22, 62, 67) проявляли фитостимулирующее действие.

В ходе эксперимента ростостимулирующие свойства выявлены так же у штамма № 3 Bacillus megaterium и штамма № 17 Bacillus cereus в отношении подземной и надземной части семян пшеницы.

Некоторые культуры ингибировали развитие растений. Это может быть связано с накоплением активных метаболитов, высокие концентрации которых подавляют прорастание семян и развитие корневой системы.

Выводы

На основании полученных результатов можно сделать заключение о том, что эпифитные штаммы № 13, 40, 50, 55, 60, 73, 79 (Bac. subtilis), штаммы № 44, 70−1 (Bac. pumilus) и штаммы № 22, 62, 67 (Bac. licheniformis), а также № 3 (Bac. megaterium) и № 17 (Bac. cereus) обладают ростостимулирующей активностью как в отношении подземной, так и надземной частей семян модельного растительного объекта.

Часть штаммов проявляли фитостимулирующие свойства только в отношении надземной — штаммы № 10, 43, 48, 57 (Bac. pumilus), № 8, 31 (Bac. licheniformis), или подземной — штаммы Bac. subtilis № 1, 20, 34, 41, 46, 49, 58, частей пшеницы.

Из 43 протестированных штаммов, проявили фитосмулирующую активность в отношении подземной и надземной частей семян пшеницы 14 штаммов всех видов бацилл. Положительно оказывали влияние на рост только надземной части растений — 6 штаммов (4 штамма — Bac. pumilus, 2 штамма — Bac. licheniformis), на рост только подземной части — 7 штаммов (Bac. subtilis).

Выделение фитогормонов бактериальными клетками в окружающую среду считается одним из важнейших составляющих эффективного растительно-бактериального симбиоза. Стимулирующий эффект выражается в том, что фитогормоны вызывают усиленный рост надземной части, корневой системы растения, что в свою очередь приводит к улучшению минерального питания. На основании результатов эксперимента in vitro, целесообразно отобрать эти штаммы для дальнейших опытов in vivo.

Таким образом, были выделены и идентифицированы некоторые представители рода Bacillus филлоплана древесных растений г. Ставрополя, обладающие ростостимулирующими свойствами. Отобранные штаммы являются потенциально перспективными в разработке микробиологических препаратов для растений.

Создана региональная коллекция штаммов эпифитных микроорганизмов, осуществляется формирование фонда перспективных штаммов с фиторегуляторной активностью, способных к синтезу индольных соединений, витаминов, активно колонизирующих ткани растений.

Экспериментальная проверка и реализация свойств и активности микроорганизмов перспективна в традиционных и новых областях биотехнологии.

Библиографический список

• 1. Возняковская Ю. М. Микрофлора здоровых растений: дис… докт. биол. наук. М., 1964. 568 с.
• 2. Заикина И. А. Экологическая роль бактериального сообщества эпифитов филлосферы в жизнедеятельности растений: автореф. дис… канд. биол. наук. Ставрополь, 2008. 21 с.
• 3. Мелентьев А. И. Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn. в агроэкосистемах. — Москва Наука, 2007. 121 с.
• 4. Недорезков В. Д. Биологическая защита пшеницы от болезней в условиях Южного Урала. — М.: Изд-во МСХА, 2002. — 172 с.
• 5. Нетрусов А. И. Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов / А. И. Нетрусов, Е. А. Бонч-Осмоловская, В. М. Горленко и др.; Под ред. А. И. Нетрусова. — М.: Издательский центр «Академия», 2004. — 272 с.
• 6. Определитель бактерий Берджи. В 2 — х т. Т. 1, 2: Пер. с англ./ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. — М.: Мир, 1997. 432 с., ил.
• 7. Пивоваров Ю. Н., Королик В. В. Санитарно-значимые микроорганизмы (таксономическая характеристика и дифференциация). — М.: Издательство ИКАР, 2000. 268 с.
• 8. Скворцова И. Н. Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus. М.: Издво Моск. ун-та, 1983. 26 с.
• 9. Холмецкая М. О., Лобанок Е. В. Продукция ИУК бактериями, взаимодействующими с растениями // Тез. докл. Всерос. конф. «Сельскохозяйственная микробиология в XIX—XXI вв.еках», 14−19 июня, 2001, Санкт-Петербург. — С.-Пб., 2001. — С. 78−79.
• 10. Compant S., Duffy B., Nowak J., Clйment C., Barka E.A. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects // Appl. Environ. Microbiol. 2005. — V.71. — P.4951^1959.