Исследование эффектов фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем на препаратах мозга и крови мышей in vitro

Для выяснения вопроса о том, насколько эстеразный профиль антихолинэстеразного соединения определяет его поведение на уровне тканей, мы исследовали ингибирование АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в 9S фракции гомогената мозга (далее препараты мозга) и в препаратах крови мышей in vitro двумя экспериментальными фосфорорганическими соединениями diEt-PFP ;

(С2H5O)2P (O)OCH (CF3)2 и diBu-PFP — (С4H9O)2P (O)OCH (CF3)2, и известным нейропатичным соединением diPr-DClVP — (C3H7O)2P (O)OCH=CCl2, выбор которых обоснован выше.

Ингибиторная активность и селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз мозга мышей in vitro

Проведено титрование активностей АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в 9S фракции гомогената мозга мышей (препараты мозга) исследуемыми соединениями. На представлены кривые титрования активности ферментов мозга мышей diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP при 20 минутной инкубации.

В результате анализа приведенных кривых получены величины IC50, (М), отражающие ингибиторную активность исследуемых ФОС в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в препаратах мозга мышей (Табл. 3.4.-1), и рассчитана селективность исследуемых соединений в отношении эстераз мозга в соответствии с уравнением: S (Ex/Ey) = IC50(Ey) / IC50(Ex) (Табл. 3.4.-2).

Таблица 3.4. — 1. Ингибиторная активность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в препаратах мозга мышей (IC50, M, t = 20 мин).

Сравнение эстеразных профилей соединений (Табл. 3.1.-6) и их ингибиторной активности в отношении эстераз мозга (Табл. 3.4.-1) показывает, что ингибиторная активность исследуемых ФОС в отношении АХЭ, БХЭ, НТЭ мозга мышей, за исключением КЭ, соответствуют эстеразному профилю соединений. Наибольшую селективность в препаратах мозга все три исследуемых соединения проявляют по отношению к БХЭ. Величины их ингибиторной селективности в отношении БХЭ по сравнению с АХЭ и НТЭ мозга (Табл. 3.4.-2) близки соответствующим величинам селективности, рассчитанным из эстеразного профиля соединений (Табл. 3.1.-7). Селективность соединений в отношении НТЭ мозга по сравнению с АХЭ также соответствует величинам RIP, полученным при анализе эстеразных профилей соединений (Табл. 3.1.-7) и, соответственно, наблюдается тот же ряд нейропатичной опасности соединений: diEt-PFP .

Все исследуемые соединения ингибируют КЭ мозга мышей заметно слабее (в 10−50 раз), чем фермент КЭ микросом печени свиньи, используемый в кинетических исследованиях для оценки эстеразного профиля соединений.

Сравнительное исследование ингибиторной активности diBu-PFP в отношении КЭ печени и КЭ мозга мышей (20 мин инкубация) показало меньшую чувствительность фермента мозга по сравнению с ферментом печени у одного вида животных: IC50= (1.5±0.16)Ч10−7 М (КЭ мозга) и (4.6±0.4)Ч10−8 М (КЭ печени).

Мы полагаем, что различная чувствительность КЭ мозга и печени к ФОС, может быть связана с присутствием разных изоформ фермента в данных тканях, отличающихся как по уровню экспрессии, так и по специфичности. Из литературных источников известно, что в мозге экспрессируется CES6 изоформа КЭ, которая является продуктом гена CES6, локализованного на хромосоме 16. CES6 является индивидуальной секретируемой формой КЭ нервной ткани млекопитающих [341] и отличается от CES1 (КЭ печени), CES2 (КЭ тонкого кишечника), являющихся продуктами соответствующих генов, локализованных на 8-й хромосоме, и экспрессирующих белки, связанные с мембранами эндоплазматического ретикулума [341].

• — исследована ингибиторная активность и селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ в препаратах мозга мышей;
• — показано, что ингибиторная активность исследуемых ФОС в отношении АХЭ, БХЭ и НТЭ мозга мышей близка к их активностям, полученным на индивидуальных ферментах, т. е., соответствует их эстеразному профилю;
• — показано соответствие ингибиторной селективности diEt-PFP, diBu-PFP diPr-DClVP в отношении АХЭ, БХЭ и НТЭ мозга мышей величинам селективностей, полученным из анализа эстеразного профиля данных соединений;
• — для КЭ мозга мышей показана меньшая ингибиторная активность исследуемых ФОС по сравнению с коммерческим препаратом КЭ микросом печени свиньи, используемым для кинетических исследований, а также по сравнению с КЭ печени мыши, что может быть связано с присутствием различных изоформ КЭ в мозге и печени.

Ингибиторная активность и селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз крови мышей in vitro

Для исследования ингибиторной активности и селективности diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP на препаратах крови мышей in vitro в сравнении с их эстеразным профилем проведено титрование активности АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в препаратах крови мышей выбранными соединениями.

На Рисунке 3.4.-2 представлены кривые титрования активности ферментов крови мышей исследуемыми соединениями при 20 минутной инкубации с ингибиторами. Из Рисунка 3.4.-2 видно, что наиболее чувствительными к действию исследуемых соединений являются неспецифические эстеразы («вторичные» мишени-скэвенджеры) — БХЭ и особенно КЭ, в меньшей степени чувствительны АХЭ и НТЭ.

В результате анализа кривых титрования определены величины IC50, отражающие ингибиторную активность исследуемых ФОС в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ в препаратах крови мышей (Табл. 3.4.-3), и рассчитаны селективности исследуемых соединений в отношении указанных эстераз крови:

S (Ex/Ey) = IC50(Ey)/IC50(Ex) (Табл. 3.4.-4).

Таблица 3.4. — 3. Ингибиторная активность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в препаратах крови мышей.

Из Таблицы 3.4.-3 видно, что ингибиторная активность соединений в препаратах крови мышей в целом ниже показателей их эстеразного профиля (Табл. 3.1.-6). Это, вероятно, можно объяснить присутствием в крови ферментов и других белков, способных изменять количество свободных молекул ингибитора путем связывания или гидролиза (например, сывороточный альбумин). При этом порядок чувствительности эстераз крови к каждому соединению соответствует его эстеразному профилю: для diEt-PFP НТЭ < АХЭ < БХЭ < КЭ, для diBu-PFP и diPr-DClVP АХЭ < НТЭ < БХЭ < КЭ.

Таблица 3.4. — 4. Ингибиторная селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ в препаратах крови мышей: S (Ex/Ey) = IC50(Ey)/IC50(Ex).

Величины ингибиторной селективности ФОС в отношении эстераз крови (Табл. 3.4.-4) хорошо соответствуют значениям, рассчитанным из эстеразных профилей данных соединений (Табл. 3.1.-7), что подтверждают высокие показатели корреляции между этими параметрами: для diEt-PFP r = 0.999, p <

0.0001; для diBu-PFP r = 0.938, p = 0.0184; для diPr-DClVP r = 0.918, p = 0.0279 (Рис. 3.4.-3).

Селективность в отношении НТЭ крови по сравнению с АХЭ для всех соединений (Табл. 3.4.-4) близки к величинам RIP, рассчитанным из их эстеразных профилей (Табл. 3.1.-7): для diEt-PFP — 0.11 и 0.07, для diBu-PFP — 6.8 и 6.6, для diPr-DClVP — 4.8 и 3.5.

Таким образом, на препаратах крови, как и на препаратах мозга мышей, ряд нейропатичной опасности соединений соответствует прогнозам эстеразного профиля: diEt-PFP << diPr-DClVP < diBu-PFP.

В результате экспериментов на препаратах крови мышей

• — исследована ингибиторная активность и селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ крови;
• — установлено, что активности исследуемых соединений в отношении эстераз крови в целом ниже, чем в отношении индивидуальных ферментов; при этом порядок чувствительности эстераз крови к каждому соединению соответствует его эстеразному профилю;
• — показано, что величины ингибиторной селективности в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ крови полностью соответствуют эстеразному профилю соединений;

Таким образом, на препаратах крови мышей diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP проявляют эффекты, соответствующие их эстеразными профилями, как точки зрения ингибиторной активности в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ, так и с точки зрения ингибиторной селективности.