Международные нанотехнологические стандарты для использования в медицине

Международную стандартизацию в области нанотехнологий и наноматериалов осуществляет Международная организация по стандартизации (International Organization for Standardization, ISO). В ее рамках создан Технический комитет стандартизации (Technical Committee, (ТС) — ISO/TC 229 «Нанотехнологии», который состоит из 4 рабочих групп (РГ): РГ1 «Терминология и номенклатура»; РГ2 «Измерения и характеристики»; РГ3 «Здоровье, безопасность и окружающая среда»; РГ 4 «Спецификации материалов».

При оценке наиболее важных исследований, которые могут серьезно повлиять на экономическое и социальное развитие стран в долгосрочной (15 — 20 лет) перспективе, эксперты в настоящее время на первое место ставят направление по разработке нанобиотехнологий и развитию материаловедения для медицины (биоматериалы, совместимые с человеческим организмом). ISO утвердила для использования 3 нанотехнологических стандарта, предназначенных для применения в медицине [1 — 3]. Ниже приводится краткое изложение указанных трех стандартов.

ISO 10 801:2010 Нанонотехнологии — Формирование методом испарения/конденсации металлических наночастиц для тестирования ингаляционной токсичности [1]. Наноразмерные частицы могут воздействовать на человека при приеме пищи, через кожу и при ингаляции (вдыхании). Для исследования ингаляционной токсичности пригодны аэрозоли серебряных наночастиц с размерами до 100 нм. Рассматриваемый международный стандарт устанавливает требования и рекомендации по созданию аэрозолей серебра методом испарения/конденсации, а также организацию и контроль воздействия аэрозолей на животных (мышей).

На рисунке 1 представлена схема экспериментальной установки для исследования ингаляционной токсичности.

Для генерации аэрозоля плоский керамический нагреватель 3, подключенный к источнику питания переменного тока 2, размещается в кварцевом корпусе 5. Этот корпус имеет диаметр 70 мм и длину 140 мм. Нагревательный элемент 3 размером 50?5?1,5 мм способен нагревать поверхность до 1500 °C. В этой области располагается исходный серебряный металл 4 (с чистотой 99,99%). Он испаряется с поверхности керамического нагревателя и превращается в неагломерированные сферические наночастицы. Они вытекают с газом-носителем, в качестве которого используется сухой фильтрованный воздух.

Рисунок 1 — Схема экспериментальной установки для исследования ингаляционной токсичности: 1 — контроллер массового расхода; 2 — источник питания; 3 — керамический нагреватель; 4 — исходный материал; 5 — кварцевая трубка; 6 — дилютор; 7 — нейтрализатор; 8 — дифференциальный классификатор мобильности; 9 — счетчик конденсированных частиц; 10 — персональный компьютер; 11 — ингаляционная камера

При создании аэрозолей должны определяться и контролироваться скорость испарения металла (мг/ч) и расход воздуха (скорость потока воздуха) (м3/ч). Скорость ламинарного потока в установке поддерживается на уровне 22 л/мин с помощью контроллера массового расхода 1. Рабочие камеры должны эксплуатироваться при более низком давлении по сравнению с окружающей средой, чтобы избежать воздействия на работников в случае утечки.

Размерное распределение наночастиц серебра определяется с помощью системы анализа дифференциальной мобильности 8 и счетчика конденсированных частиц 9.

Требования к получаемым наночастицам включают соблюдение их размеров и химической чистоты. Размерное распределение частиц зависит от температуры нагревателя. Анализ размера наночастиц, выполненный до взаимодействия системы, образующей наночастицы, с ингаляционной камерой 11, показывает, что при варьировании температуры в пределах 1002 — 1351 0С средний размер частиц изменяется от 8 до 20 нм. Представленные данные получены при расходе газа-носителя 4 л/мин, который должен быть постоянным, и исходной массе загруженного серебра 14,76 мг.

По электронно-микроскопическим изображениям видно, что наночастицы имеют сферическую форму и не агломерированы. Однако, поскольку частицы, зародившиеся на небольшой поверхности нагревателя, вытекают с воздухом-носителем, коагуляция частиц быстро уменьшается за счет закалки и эффекта разжижения.

Для оценки воздействия на здоровье наноразмерные частицы вводятся в ингаляционную камеру 11 с экспериментальными животными, которых впоследствии проверяют на ингаляционную токсичность. Как показано на рисунке 2, концентрация наночастиц серебра в камере является стабильной в течение 90-дневного исследования ингаляционной токсичности.

n — количество (? 106 частиц/см3); t — время, дни;

Рисунок 2 — Сохранение концентраций в течение 90-дневной генерации наночастиц серебра и ингаляционного воздействия: 1 — высокая концентрация; 2 — средняя концентрация; 3 — низкая концентрация.

Одновременно с контролем концентрации должны контролироваться внутренняя и поверхностная чистота наночастиц на соответствие техническим требованиям к процессу исследования.

Протокол испытаний должен включать:

• а) полную идентификацию исходного материала изготовленных наночастиц (код производителя, номер каталога или состава, номер партии или дата изготовления, торговая марка и т. д.);
• б) процедуры подготовки проб для испытаний;
• в) показатели количества и размерного распределения наночастиц.

ISO 10 808:2010 Нанотехнологии — Определение параметров наночастиц в ингаляционных камерах для тестирования ингаляционной токсичности [2]. Число нанотехнологических потребительских продуктов, содержащих наночастицы серебра, золота, углерода, оксида цинка, диоксида титана и кремнезема, растет очень быстро. В целях проведения изучения влияния наноразмерных частиц на ингаляционную токсичность, необходим контроль концентрации, размера и распределения наноразмерных частиц в ингаляционной камере.

Стандарт предлагает набор контролирующих камер тестирования ингаляционной токсичности и соответствующую систему анализа дифференциальной мобильности. Последняя необходима для определения числа частиц, их размера, распределения частиц по размерам, площади поверхности и расчетной дозы массы, а также для морфологического исследования и определения химического состава.

На рисунке 3 показана схема установки, вырабатывающей наночастицы и обеспечивающей распределение наночастиц серебра, полученных из чистой серебряной (99,99% по объему) проволоки. Режимы генератора наночастиц: приложенное напряжение — 85 В (при 1130°C) и расход при воздушном течении — 30 л/мин.

Рисунок 3 — Установка распределения и мониторинга концентраций дискретных наночастиц при изучении ингаляционной токсичности: 1 — 4 — ингаляционные камеры: 1 — контрольная, 2 — с наименьшей концентрацией частиц, — со средней концентрацией, 4 — с наибольшей концентрацией; 5 — фильтры; 6 — контроллер течения массы; 7 — генератор частиц; 8 — дилютор; 9 — пылевой фильтр; 10 — вытяжной вентилятор; 11 — химический скруббер; 12 — система анализа дифференциальной мобильности (САДМ) (см. 7- 10 на рисунке 2)

Установка производит наночастицы в различных концентрациях (высокая, средняя и низкая) в трех отдельных камерах. Распределение наночастиц по размерам определятся непосредственно в каждой отдельной камере. Рисунок 4 иллюстрирует распределения серебряных наночастиц, измеренных в трех камерах. Распределение по размерам частиц серебра контролировалось после 18 ч с целью определения неустойчивости.

Рисунок 4 иллюстрирует различия в концентрации частиц во времени в отдельных экспозиционных камерах, а рисунок 5 — изменения численной концентрации /генерации наночастиц серебра в течение длительного времени.

Рисунок 4 — Распределение частиц по размерам в камерах с высокой, средней и низкой концентрацией частиц: 1 — фракция высокой концентрации; 2 — фракция средней концентрации; 3 — фракция низкой концентрации; а, b — скорость течения в дилюторах: 5,75 л/мин.

Х — текущий диаметр, Dp (нм); Y — dN/dlog (Dp), частиц/см3.

Рисунок 5 — Изменения численной концентрации/генерации наночастиц серебра в течение длительного времени в камерах: 1 — камера высокой концентрации; 2 -средней концентрации; 3 -низкой концентрации.

Х — время (в часах); Y — общая концентрация (число частиц/см3); Y1 — общее генерирование частиц (число частиц/сек).

Вообще, относительно наночастиц должны быть получены следующие данные:

• а) распределение наночастиц (в нанометрах), средний геометрический диаметр и его нормативное отклонение в каждой экспозиционной камере;
• б) морфология частиц с помощью просвечивающей или сканирующей электронной микроскопии;
• в) количественная концентрация (в виде частиц на кубический сантиметр) в каждой экспозиционной камере;
• г) массовая концентрация наночастиц, введенных в каждую экспозиционную камеру;
• д) химический состав наночастиц.

Точная характеристика действия испытуемого вещества имеет важное значение для исследования ингаляционной токсикологии. Целью токсикологии ингаляционных наночастиц является установление количественных соотношений между наблюдаемыми токсикологическими результатами и метрической дозой, используемых в терминах физических и химических свойств исследуемого вещества.

ISO 29 701:2010 Нанотехнологии — Анализ образцов из наноматериалов на содержание эндотоксина в случае in vitro систем — Анализ с использованием Limulus amebocyte lysate [3] ¹⁾ Лизат амебоцитов Limulus (LAL) — хромогенный метод определения эндотоксина (LAL-тест).). Эндотоксины, содержащие активные липополисахариды, входят в состав наружных мембран клеточных стенок грам-отрицательных бактерий, таких как кишечные палочки, сальмонеллы, шигеллы и др.

Эндотоксины могут вызвать целый ряд системных реакций у млекопитающих, включая человека, такие как лихорадка, диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови, артериальная гипотензия, шок и смерть. Эндотоксины присутствуют в обычной среде и могут загрязнять исследуемые наноматериалы.

Что касается приготовления порошковых образцов для испытания на загрязнение, то дисперсии могут быть получены одним или несколькими из следующих способов: ручным шлифованием, механическим фрезерованием, при ультразвуковой обработке. Испытуемый образец должен быть проверен сразу после приготовления.

Рассматриваемый стандарт дает представления о применении LAL-теста к образцам наноматериалов, диспергированных в жидкой среде, например, воде, сыворотке или реакционной среде. Эндотоксины активируют в LAL движущую силу, которая вызывает в конечном итоге образование гель-тромба. Это образование определяется при перевороте пробирки, при котором гель не должен вытекать.

Гель-тромбный метод предполагает использование эндотоксина в виде лиофилизированного порошка. Приготовляются растворы эндотоксина в воде четырех концентраций — 0,25, 0,5, и 2. Здесь — маркировочная чувствительность, выраженная в EЭ/мл ⁾ ЕЭ — эндотоксиновая единица; нормативная единица активности эндотоксина.). Гель-тромбный метод позволяет измерять величину = 0,015 ЕЭ/мл. Самую низкую концентрацию называют конечной концентрацией. В качестве конечной концентрации в исследуемом образце должна быть представлена среднегеометрическая концентрация эндотоксина. Среднее геометрическое из четырех конечных концентраций, с, в калибровочном нормативе определяется как чувствительность LAL-реактива в воде, свободного от эндотоксина, следующим образом:

.

где — сумма конечных концентраций использованной серии растворений, f — число измерений.

Чувствительность LAL-реактива в воде, свободного от эндотоксина, должна быть в пределах от 0,5 до 2 .

Протокол испытаний должен включать:

• а) результаты испытаний;
• б) процедуры испытаний;
• в) полную идентификацию тестируемых наноматериалов;
• г) порядок подготовки образца к исследованию, условия хранения испытуемых образцов и сведения о классификации используемых лабораторных условий;
• д) идентификацию LAL-реактива (торговое название, код производителя, каталог или формулировочный номер, номер партии или дата изготовления, чувствительность и т. д.);
• е) определение нормативного эндотоксина (торговое название, код производителя, каталог или номер формулировки, номер партии или дату изготовления, эффективность и т. д.);
• ж) обоснованность испытания, включая столкновение патентных притязаний на опытный образец.

Следует отметить, что до сих пор остается окончательно не утвержденным определение основополагающего термина «наноматериал». В соответствие со стандартом [4, ч.1], наноматериал — это материал по крайней мере с одним внешним наномасштабным размером. В октябре 2011 года, через год после редакционной работы и консультаций с общественностью, опубликовано определение в следующей редакции: «наноматериал» означает естественный, случайный или промышленный материал, содержащий частицы в несвязанном состоянии или в виде агрегата или в виде агломерата, и в котором у 50% или более частиц один или более из внешних размеров находятся в диапазоне 1 — 100 нм [5].

При этом сделано следующее примечание: в отдельных случаях, когда это оправдано озабоченностями относительно окружающей среды, здоровья, безопасности или конкурентоспособности, граница размерного распределения 50% может быть заменена на пределы от 1 до 50%. Такие объекты, как фуллерены, графеновые чешуйки и одностенные углеродные нанотрубки, с одним или более внешними размерами менее 1 нм следует рассматривать в качестве наноматериалов. Определение исключает наноструктурные материалы, имеющие внутренние или поверхностные структуры в диапазоне 1−100 нм (например, электронные компоненты).

В работе [5] вместе с тем отмечается, что ситуация, возникшая с новой формулировкой, остается, тем не менее, спорной в связи с научными проблемами (выбор соответствующих метрических показателей, физические и химические состояния, диапазон размеров, распределение по размерам и т. д.), различными обстоятельствами, относящимися к обдумываемому контексту (например, нормативность, научные цели, области применения и т. д.), а также в связи с возможными техническими и экономическими последствиями.

В заключение следует отметить, что международные стандарты ISO не являются обязательными, т. е. каждая страна-член ISO вправе применять их целиком, частично или вообще не применять. Однако страны, стремящиеся поддерживать конкурентоспособность своей продукции на мировом рынке, вынуждены применять эти стандарты. Среди указанных стран следует в первую очередь назвать Соединенные Штаты Америки, такие страны Европейского Союза, как Франция, Германия, Швейцария, Нидерланды и Великобритания. В числе стран-членов ISO находится Россия и Украина, предприятия и специализированные научные организации которых занимаются разработками и исследованиями в области наноматериалов и нанотехнологий.

• 1. ISO 10 801:2010 Nanotechnologies Generation of metal nanoparticles for inhalation toxicity testing using the evaporation/condensation method.- Ed. 2010;12−15. — ISO, 2010. -22 p.
• 2. ISO 10 808:2010 Nanotechnologies Characterization of nanoparticles in inhalation exposure chambers for inhalation toxicity testing. — Ed. 2010;12−15. — ISO, 2010. -18 p.
• 3. ISO 29 701:2010 Nanotechnologies Endotoxin test on nanomaterial samples for in vitro systems Limulus amebocyte lysate (LAL) test. — Ed. 2010;09−15. — ISO, 2010. -20 p.
• 4. ISO/TS 80 004 Nanotechnologies — Vocabulary — Part 1−7. — Ed. 2010 — 2012. — ISO, 2012.
• 5. Montovani Е., Porcari А., Моrrison M.D. and Geertsma R.E. Developments in Nanotechnologies. Regulation and Standards 2012 — Report of Observatory Nano. April 2012. Электронный ресурс. Режим доступа: www.observatorynano.eu