Лабораторная работа № 3. Запасные питательные вещества в клетках микроорганизмов, дрожжей

Цель работы: ознакомится с морфологическими признаками клеток дрожжей.

Задачи работы: является изучение культуральных свойств отдельных классов, а также осваивание методов приготовления препаратов. И изучение запасных веществ в клетке дрожжей. Выявить гранулы гликогена в клетках дрожжей. Выявить липидные гранулы в клетках дрожжей. Выявить полифосфатные гранулы в клетках дрожжей.

Оборудование: Микроскоп, предметные стекла, покровные стекла, пинцет, бактериологическая петля, спиртовка, спички, карандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипетки объемом 1 и 2 см³, дистиллированная вода, чистые культуры дрожжей, красители (кристаллвиолет, фуксин Циля, метиленовый синий, основной фуксин, карболовый фуксин, малахитовый зеленый), раствор Люголя, этиловый спирт, иммерсионное масло для микроскопии.

Ход работы:

1. Приготовили мазок из чистой культуры дрожжей. 2. Окрасили фиксированный мазок по Грамму. 3. Полученный препарат рассмотрели под иммерсией.

Методы окрашивания основаны либо на микроскопировании в видимом (обычном) свете. Красителями для светового микроскопа являются метиленовый синий, раствор Люголя и др.

Окраска дрожжей метиленовым синим производили по методу выявления мертвых клеток с помощью метиленового синего. После попадания в клеточную цитоплазму под действием ферментов редуктаз этот краситель восстанавливается живыми дрожжевыми клетками до бесцветных соединений. Мертвые клетки окрашиваются в синий цвет. Эффективность данного метода зависит не только от состояния клеточной мембраны, но и от активности оксидоредуктаз в клетке.

Приборы и посуда: микроскоп; предметные и покровные стекла; тонкая стеклянная палочка. Реактивы: метиленовая синь. Материалы: суспензия дрожжей концентрацией около 107 клеток/мл.

Методика окрашивания: Для определения количества мертвых клеток на предметное стекло наносят по одной капле нефильтрованной дрожжевой суспензии и раствора метиленовой сини (1:5000). Каплю закрывают покровным стеклом, излишек жидкости собирают листком фильтровальной бумаги и через 2 мин наблюдают окрашенный препарат с помощью микроскопа. В поле зрения микроскопа считают общее количество дрожжевых клеток, затем только синие, после чего препарат передвигают и подсчет ведут в новом поле зрения. Таким образом подсчитывают общее количество клеток (не менее 500) в пяти полях зрения. После подсчета вычисляют количество мертвых клеток в процентах [3].

Методические указания — большинство микроорганизмов могут синтезировать запасные вещества. Это полимерные молекулы, нерастворимые в цитоплазме, и поэтому они не вовлекаются в клеточный метаболизм. Запасные вещества синтезируются, если в питательной среде не хватает некоторых элементов, необходимых для роста бактерий (источники азота или фосфора), либо присутствуют ингибиторы роста. Бактерии не имеют возможности размножаться, однако поглощают питательные вещества из окружающей среды. Часть этих веществ полимеризуется в клетке, превращаясь в запасные вещества. Когда в окружающей среде появляются недостающие элементы для роста или из нее удаляется ингибитор роста бактерий, в клетке активируются гидролитические ферменты, расщепляющие запасные полимеры до мономеров. Мономеры растворяются в цитоплазме и активно включаются в метаболизм. Синтез запасных веществ имеет экологический смысл.

В природе отдельные виды бактерий не существуют обособленно от других. Бывает, что нехватка некоторых элементов тормозит размножение одних видов, но не влияет на размножение других видов бактерий. Когда в окружающей среде появляются необходимые компоненты, может оказаться, что активно размножающиеся бактерии практически полностью использовали основной субстрат. В таких случаях запасные вещества, гидролизуясь в клетке, становятся источником энергии и углерода. Некоторые запасные вещества становятся источником фосфора.

Основными запасными веществами микроорганизмов являются:

• 1. Полимеры глюкозы. Наиболее часто встречаются гликоген и крахмал. Мономер глюкоза, образующаяся при расщеплении этих запасных веществ, является источником энергии и углерода в клетке.
• 2. Полиоксикислоты. Мономерами являются оксикислоты — источник энергии и углерода. Оксикислоты, образующиеся при расщеплении полиоксикислот, являются строительным материалом при биосинтезе клеточных мембран.
• 3. Полифосфаты. Мономер — фосфат. Фосфаты необходимы клетке для синтеза ряда важных молекул.

Для непосредственного выполнения этой работы необходимы предметные стекла, микробиологические петли, микроскопы, осветители, колодка с раствором Люголя, сафранином, суданом III, метиленовым синим по Л? ффлеру, 1%-ным раствором серной кислоты, микробиологические мостики для окрашивания препаратов, спиртовки для работы в стерильных условиях, спички, лабораторные стаканы с суспензией дрожжей Saccharomyces serevisiae, в которую добавлены небольшое количество сахарозы и 1−2 капли 1%-ной серной кислоты, фильтровальная бумага для высушивания готовых препаратов, ёмкости с дезинфицирующим раствором для использованных предметных стекол. В вытяжном шкафу находится ксилол.

• 1. Выявление гранул гликогена. Так как гликоген является веществом углеводной природы, его выявляют обработкой клеток раствором Люголя. Для этого на предметное стекло помещают небольшую каплю суспензии дрожжей, добавляют в нее каплю раствора Люголя, накрывают покровным стеклом и микроскопируют с объективом 40. Во избежание попадания влаги на объектив, избыток жидкости, выступающей за края покровного стекла необходимо удалить кусочками фильтровальной бумаги. В поле зрения видны клетки дрожжей, окрашенные в желтый цвет. Гранулы гликогена внутри дрожжей окрашены в коричневый цвет.
• 2. Выявление липидных гранул. Готовят тонкий мазок клеток, высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки. Для окрашивания гранул используют липофильный краситель Судан III. Красителем заливают мазок на 12 минут, затем сливают. Для обесцвечивания цитоплазмы препарат, не промывая, несколько раз погружают в ксилол. После этого клетки в течение 10 секунд дополнительно окрашивают сафранином, так как без окраски цитоплазмы дрожжи не будет видно в микроскоп. На последней стадии приготовления препарата краситель тщательно смывают водой, препарат просушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют. Используемый объектив — 90. В поле зрения на розовом фоне цитоплазмы дрожжей видны липидные гранулы темно-красного цвета. Окраска сафранином более 10 секунд нежелательна, так как цитоплазма в этом случае окрашивается в более темный цвет. В этом случае окраска фона будет сливаться с окраской гранул.
• 3. Выявление гранул полифосфатов. Готовят тонкий мазок клеток, высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки. На мазок наносят метиленовый синий по Л? ффлеру и окрашивают в течение 3 минут. Краситель сливают, препарат промывают водой, не высушивают. На мазок наносят каплю 1%-ного раствора серной кислоты, накрывают покровным стеклом и микроскопируют с объективом 40. Для предохранения объектива от повреждений избыток жидкости, выступающей за края покровного стекла, необходимо удалить кусочками фильтровальной бумаги. Гранулы полифосфата имеют свойство изменять цвет некоторых красителей, в том числе метиленового синего. Поэтому в поле зрения на слабоголубом фоне цитоплазмы видны гранулы, окрашенные в сине-фиолетовый цвет [4].

Результаты работы:

При изучении гликогена в дрожжевых клетках было установлено, что они желтого цвета с коричневыми вкраплениями в одних клетках количество гликогена было едва заметным в других занимало почти половину.

Рис. 4. — Окрашивание гликогена в дрожжевых клетках

При окрашивании можно заметить клетки не окрашенные, которые не являются дрожжевыми клетками.

Выявление липидных гранул было также произведено и проведена окраска клеток (рисунок 5).

Рис. 5 — Липидные гранулы в дрожжевых клетках

При окрашивании было установлено, что сами клетки окрасились в розовый цвет, а липидные гранулы выглядели в виде коричневых включений в клетках дрожжей.

Рис. 6. Гранулы полифосфатов — окрашенные

Завершающим этапом проведения лабораторной работы является определение гранул полифосфатов в клетках микроорганизмов (рисунок 6). Под увеличение микроскопа можно была увидеть слабоголубого цвета цитоплазму клетки и включения в них окрашенные синефиолетовым цветом.