Определение примесей в таблетированной форме фармацевтических препаратов

Определение примесей в таблетках диазепама и феназепама методом двухступенчатой капиллярной газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием Определение примесей в фармацевтических препаратах является важной и актуальной задачей, так как состав примесей определяет качество продукта и позволяет судить о производителе продукции и ее фальсификации, которая принимает все большие масштабы во всех странах мира. Необходимо также отметить, что в ряде случаев примеси, присутствующие в препарате в следовых концентрациях, по своей токсичности намного превосходят токсичность основного компонента.

Одно из ведущих мест в анализе фармацевтических препаратов на содержание органических примесей (как правило, заданных) занимает высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). При обнаружении и определении неизвестных примесей возможности этого метода весьма ограничены. УФ-детектор с диодной матрицей, как наиболее селективный, часто используется при определении заданных примесей в фармацевтических препаратах, однако для идентификации неизвестных примесей в фармацевтических препаратах данный детектор использован не был. Принципиально диодно-матричный детектор может быть использован для этой цели путем сравнения спектра со спектром библиотеки, однако УФ-спектры не так характеристичны, как масс-спектры, и после идентификации соединения по УФ-спектру ее необходимо подкрепить применением таких методов как ГХ/МС или ВЭЖХ/МС. Сочетание ВЭЖХ с массспектрометрией (МС) используют в большинстве случаев для подтверждения известных (заданных) примесей, присутствующих в фармацевтической продукции. Возможности такого сочетания для идентификации неизвестных примесей весьма ограничены; это обусловлено возможностью потери информации о ряде компонентов смеси из-за различных ион-молекулярных реакций примесей в элюенте, а также регистрацией только молекулярных масс компонентов смесей (когда это возможно). В ряде случаев для идентификации примесей используют выделение соответствующих фракций, их концентрирование с заменой растворителя и последующую регистрацию спектров ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (если это возможно — в связи с низкой чувствительностью метода ЯМР). Помимо ВЭЖХ, для контроля содержания заданных примесей в фармацевтической продукции используют высокоэффективную тонкослойную хроматографию и реже газовую (ГХ), сверхкритическую флюидную хроматографию и капиллярный электрофорез. Каждый из этих методов имеет определенные преимущества перед ВЭЖХ, однако их ограничениями являются селективность, эффективность, емкость колонки и чувствительность детектора.

Для большинства термостабильных летучих и среднелетучих соединений идентификация примесей наиболее легко и эффективно обеспечивается использованием сочетания капиллярной газовой хроматографии с масс-спектрометрией (ГХ/МС). Одним из возможных методов, позволяющих одновременно снизить предел обнаружения примесей и улучшить чувствительность, эффективность и селективность анализа, является метод двухступенчатой off-line капиллярной газовой хроматографии (КГХ) в сочетании с масс-спектрометрией.

Известно, что бензодиазепины, в том числе диазепам и феназепам, удовлетворяют требованиям метода ГХ/МС по своей летучести и термостабильности. В частности, их метаболизм и фармакокинетика были успешно изучены методами ГХ и ГХ/МС.

В связи с этим целью настоящей работы являлось изучение возможности определения примесей в таблетированной форме рассматриваемых фармацевтических препаратов с использованием двухступенчатой КГХ в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием в режиме off-line.

Экспериментальная часть В качестве объектов исследования были выбраны два фармацевтических препарата в таблетированной форме, активными веществами которых являлись диазепам (7-хлор-2,3-дигидро-1-метил-5-фенил-1Н-1,4-бензодиазепин-2-он) и феназепам (7-бром-5-(ортохлорфенил)-2,3-дигидро-1Н-1,4-бензодиазепин-2-он).

Для приготовления рабочего раствора диазепама одну таблетку (с содержанием активного компонента 5 мг) растирали в порошок в ступке. Порошок растворяли в 6 мл ацетонитрила, при растворении использовали активацию ультразвуковым полем в течение 30 мин. Затем раствор центрифугировали 15 мин со скоростью 5000 об/мин. Жидкость над осадком сливали и для получения более концентрированного раствора 2,0 мл полученного раствора упаривали в токе азота при комнатной температуре до 200 мкл.

Для приготовления рабочего раствора феназепама пять таблеток (с содержанием активного компонента 0,5 мг) растирали в порошок в ступке. Далее феназепам извлекали 6 мл ацетонитрила по той же методике, которая описана для извлечения диазепама. Для холостых опытов 2,0 мл растворителя — ацетонитрила — упаривали до 200 мкл.

Первую ступень двухступенчатой КГХ в режиме off-line с концентрированием примесей осуществляли с использованием газового хроматографа «DANI 6500» с пламенно-ионизационным детектором (ПИД). Разделение проводили на капиллярной кварцевой колонке 0,5 м х 0,32 мм х 1 мкм с неподвижной фазой RTX-5 фирмы Restec (США). Режим программирования температуры колонки: 50° С (3 мин) > 30°/мин > 250 °C (6 мин). Температура испарителя хроматографа составляла 250 °C, температура ПИД — 250 °C. Колонку к детектору и инжектору присоединяли без поддува и сброса потока. В качестве газа-носителя использовали водород со скоростью потока 5 мл/мин. Для сбора и обработки хроматографических данных использовали программное обеспечение «Chrom — Card» для Windows 3.1 Server Ver. 1.1.

Концентрирование примесей осуществляли на сорбционном картридже, подключенном к выходу капиллярной колонки (см. рисунок).

Картридж представлял собой металлическую трубку длиной 4 см и внутренним диаметром 3 мм, наполненную тенаксом (длина слоя 1,6 см) и хромосорбом W с 15% SE-30 (длина слоя 1,6 см). Зоны сорбентов внутри трубки отделялись друг от друга кварцевой ватой. Улавливание веществ проводили при потоке газа-носителя, направленном от слоя хромосорба W с 15% SE-30 к слою тенакса.

Для концентрирования примесей на первой ступени двухступенчатой КГХ в режиме off-line использовали систему, представленную на рисунке.

Схема установки для двухступенчатой off-line КГХ: (1, 10 — вентиль «открыт/закрыт»; 2 — кран тонкой регулировки; 3 — манометр; 4 -инжектор хроматографа; 5 — ГХ колонка; 6 — термостат ГХ; 7 — тройник; 8 — ПИД; 9 — сорбционный катридж).

На конце разделительной колонки был установлен тройник (7), позволяющий направлять поток газа-носителя на сорбционный картридж (9) и частично ПИД (при открытом вентиле 10) или полностью через ПИД (8) (при закрытом вентиле 10). Примеси на сорбционном картридже концентрировали по следующей схеме. Отбирали 5 мкл рабочего раствора и вводили его непосредственно в инжектор ГХ, при этом вентиль 10 был открыт. Для сброса основной части активного компонента (диазепама или феназепама) вентиль 10 закрывали после начала выхода пика основного компонента, а после окончания его выхода открывали (с 7,5 по 12,4 мин при анализе раствора диазепама и с 8,4 по 12,4 мин при анализе раствора феназепама). Эту операцию повторяли два раза. Начало и конец выхода пика основного компонента определяли в предварительном опыте.

Для определения сконцентрированных примесей на второй ступени использовали систему ГХ/МС (газовый хроматограф фирмы «Varian» (США) модели 3400 с масс-спектрометрическим детектором «Incos 50» фирмы «Finnigan МАТ» (США) в режиме ионизации электронным ударом). Для перевода адсорбированных соединений в капиллярную колонку ГХ картридж с помощью иглы соединяли с испарителем хроматографа и осуществляли термодесорбцию, нагревая картридж потоком горячего воздуха (250 °С), при этом поток газа-носителя пропускали через картридж в направлении, обратном направлению потока при улавливании.

Термодесорбированные примеси разделяли на капиллярной кварцевой колонке 30 м х 0,32 мм х 0,5 мкм с неподвижной фазой CPSil 24 СВ. Режим программирования температуры колонки: 50 °C (10 мин) > 10°/мин > 290 °C (20 мин). Температура испарителя хроматографа составляла 270 °C. Пробу вводили в режиме без деления потока. В качестве газа-носителя использовали гелий со скоростью потока 1,5 мл/мин. Температура переходной линии составляла 260 °C, температура источника ионов — 180 °C, энергия электронов — 70 эВ, диапазон сканируемых масс от 50 до 500 а.е.м., скорость сканирования — 2 скан/с.

До определения примесей в исследуемых образцах методом двухступенчатой off-line КГХ/МС сначала регистрировали примеси без концентрирования, вводя пробу (1 мкл) рабочего раствора непосредственно в инжектор хроматомасс-спектрометра. Примеси определяли в условиях, описанных для второй ступени. Предварительно провели холостой опыт, проанализировав 1 мкл ацетонитрила, упаренного в 10 раз, в тех же условиях. При обработке хроматомасс-спектрометрических данных учитывали результаты холостого опыта. Холостым опытом при определении примесей методом двухступенчатой off-line КГХ/МС являлся предварительно проведенный анализ ацетонитрила, упаренного в 10 раз, в условиях двухступенчатой offline КГХ/МС.

Для обработки хроматомасс-спектрометрических данных использовали программное обеспечение GCQ версии 2.2. Неизвестные примеси идентифицировали сравнением масс-спектра неизвестного соединения с базой данных NIST (National Institute of Standards and Technology, USA). Отнесение спектра к определенной структуре считали достоверным, если значения коэффициентов сходимости при прямом и обратном библиотечном поиске были больше 700.

Содержание примесей оценивали с использованием метода внешнего стандарта — раствора нафталина-d8 с концентрацией 1 * 10 -8 г/мкл. Проводили 6 параллельных опытов, относительное стандартное отклонение при определении примесей составило не более 0,25.

Результаты и их обсуждение Данные по определению примесей в диазепаме и феназепаме методом хроматомасс-спектрометрии представлены, соответственно, в табл. 1 и 2.

Таблица — Примеси, определенные в препарате диазепама при прямом вводе 1 мкл раствора препарата в хроматомасс-спектрометр, и оценка их содержания в таблетке (n = 6; Р = 0,95; Sr ?0,25)

* - здесь и далее масс-спектры приведены в следующей форме: молекулярный ион (если он наблюдается), пять наиболее интенсивных ионов в спектре в порядке убывания значений массовых чисел ионов (для изотопных галогенсодержащих ионов приведены пики только 35Cl и 79Br-содержащих ионов)

Таблица — Примеси, определенные в препарате феназепама при прямом вводе 1 мкл раствора препарата в хроматомасс-спектрометр, и оценка их содержания в таблетке (n = 6; Р = 0,95; Sr ?0,25)

Как видно из приведенных данных, в препарате диазепама было зарегистрировано только три примеси на уровне 10−3 — 10−2%, из них идентифицированы две примеси, а в препарате феназепама — 7 примесей на уровне 10 -3 — 10 -5%, из них идентифицированных — 3.

Результаты обработки данных по определению сконцентрированных примесей в таблетках диазепама и феназепама методом двухступенчатой off-line КГХ представлены соответственно в табл. 3 и 4.

Таблица — Примеси, определенные в препарате диазепама двухступенчатой КГХ/МС в варианте off-line, и оценка их содержания в одной таблетке (n = 6; Р = 0,95; Sr ?0,25)

Таблица — Примеси, определенные в препарате феназепама двухступенчатой КГХ/МС в варианте off-line, и оценка их содержания в одной таблетке (n = 6; Р = 0,95; Sr ?0,25)

феназепам диазепам хроматография В диазепаме определено 28 примесей на уровне 10−4 — 10−2%, оценка суммарного содержания которых составила около 0,2%. В феназепаме определено 26 примесей на уровне 10−4 — 10−1%, и оценка их суммарного содержания составила около 0,5%. Таким образом, с использованием предложенного метода двухступенчатой КГХ в режиме off-line можно определять значительно большее число примесей и на более низком уровне по сравнению с прямым ГХ/МС определением.

В Фармакопее США регламентированы следующие примеси в диазепаме: 5-хлор-2-(метиламин)бензофенон (не более 0,01%), 3-амино-6-хлор-1-метил-4-фенилкарбостирил (не более 0,1%) и 7-хлор-1,3-дигидро-5-фенил-2Н-1,4-бензодиазепин-2-он (не более 0,3%). Как видно из данных, представленных в табл. 1 и 3, ни одна из регламентированных примесей не была определена при прямом вводе в ГХ/МС и две из регламентированных примесей были определены двухступенчатой off-line КГХ/МС на уровне 0,03% и 0,004%.

Можно предположить, что часть определенных примесей, не относящихся к классу бензодиазепинов, возможно, связана с наличием наполнителей в таблетках или является продуктами деструкции в процессе концентрирования и термодесорбции с картриджа. Известно, что, в качестве вспомогательных веществ в таблетках диазепама и феназепама могут быть использованы такие вещества, как глюкоза, сахар, крахмал, лактоза, стеариновая кислота, метилцеллюлоза, карбоксицеллюлоза, аэросил, тальк, полиэтилоксид и другие вещества. По-видимому, идентифицированные примеси, приведенные в табл. 1 — 4, не характерны как для самих перечисленных наполнителей (большая часть которых удаляется в процессе пробоподготовки), так и продуктов их возможной деструкции. Часть неидентифицированных примесей может относиться к наполнителям таблеток. Доказательством отсутствия деструкции примесей и основных веществ в процессе концентрирования и термодесорбции с картриджа является наличие четких хроматографических пиков, соответствующих этим веществам, на хроматограммах, зарегистрированных как для растворов этих веществ при прямом вводе в ГХ/МС, так и для десорбированного содержимого картриджа. Кроме того, об отсутствии термодеструкции примесей при термодесорбции свидетельствует примерно одинаковое содержание одних и тех же примесей в препарате, зарегистрированных до и после концентрирования. Отдельно следует отметить следующий факт: среди примесей, определенных методом двухступенчатой КГХ/МС, есть ряд веществ, содержание которых оценено на относительно высоком уровне (10−3-10−2%), но в то же время, эти примеси не определены при прямом вводе в хроматомасс-спектрометр. Это может быть, во-первых, обусловлено различной чувствительностью масс-спектрометрического детектора (МСД) к разным веществам, а также разной формой хроматографических пиков при содержании примеси на уровне 10−4-10−3% (до концентрирования) и на уровне 10−3-10−2% (после концентрирования). В первом случае пик может быть более размытым и иметь меньшую высоту и, следовательно, не быть различимым МСД, а после концентрирования он становится более четким и легко различимым.

Таким образом, с использованием метода, основанного на двухступенчатой КГХ в режиме off-line в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием, определены примеси в таблетированной форме фармацевтических препаратов, активными веществами которых являлись диазепам и феназепам. В препарате диазепама зарегистрировано 28 примесей на уровне 10−4-10−2% (из них идентифицировано 13), в то время как при прямом вводе пробы в инжектор хроматомасс-спектрометра обнаружено только 3 примеси на уровне 10−3- 10−2%. В препарате феназепама зарегистрировано 26 примесей на уровне 10−4 — 10 -1% (из них идентифицировано 14), а при прямом вводе пробы обнаружено 7 примесей на уровне 10−3-10−1%. Оценка суммарного содержания всех зарегистрированных примесей в случае диазепама составила около 0,2%, в случае феназепама — около 0,5%.