Физико-химические методы определения гликолевой кислоты

При вытеснительном варианте в сорбент вводится разделяемая смесь, а затем поток газа-носителя, содержащего вытеснитель (элюент), при движении которого смесь через некоторый период времени разделится на зоны чистых веществ, между которыми окажутся зоны их смеси. Ряд видов хроматографии осуществляется с помощью приборов, называемых хроматографами, в большинстве из которых реализуется проявительный вариант хроматографии. Хроматографы используют для анализа и для препаративного разделения смесей веществ. При анализе разделённые в колонке хроматографа вещества вместе с элюентом попадают через различные промежутки времени в установленное на выходе из хроматографической колонки детектирующее устройство, регистрирующее их концентрации во времени.

Полученную в результате этого выходную кривую называют хроматограммой. Для качественного хроматографического анализа определяют время от момента ввода пробы до выхода каждого компонента из колонки при данной температуре и при использовании определённого элюента. Для количественного анализа определяют высоты или площади хроматографических пиков с учётом коэффициентов чувствительности используемого детектирующего устройства к анализируемым веществам. Для анализа и разделения веществ, переходящих без разложения в парообразное состояние, наибольшее применение получила газовая хроматография, где в качестве элюента (газа-носителя) используются гелий, азот, аргон. Для газо-адсорбционного варианта хроматографии в качестве сорбента (частицы диаметром 0,1−0,5 мм) используют силикагели, алюмогели, молекулярные сита, пористые полимеры и другие сорбенты с удельной поверхностью 5−500 м2/г. Для газо-жидкостной хроматографии сорбент готовят нанесением жидкости в виде плёнки (высококипящие углеводороды, сложные эфиры, силоксаны) толщиной несколько мкм на твёрдый носитель с удельной поверхностью 0,5−5 м2/г и более. Рабочие температурные пределы для газо-адсорбционного варианта хроматографии от -70 до 6000С, для газо-жидкостного от -20 до 4000С. Газовой хроматографией можно разделить несколько см3 газа или мг жидких (твёрдых) веществ; время анализа от нескольких секунд до нескольких часов.

В жидкостной колоночной хроматографии в качестве элюента применяют легколетучие растворители (например, углеводороды, эфиры, спирты), а в качестве неподвижной фазы — силикагели (силикагели с химически привитыми к поверхности различными функциональными группами — эфирными, спиртовыми), алюмогели, пористые стекла; размер частиц всех этих сорбентов несколько мкм. Подавая элюент под давлением до 50 Мн/м2 (500 кгс/см2), удаётся сократить время анализа от 2−3 часов до нескольких минут. Для повышения эффективности разделения сложных смесей используют программируемое во времени изменение свойств элюента путём смешения растворителей разной полярности (градиентное элюирование). Жидкостная молекулярно-ситовая хроматография отличается использованием сорбентов, имеющих поры строго определённого размера (пористые стекла, молекулярные сита, в том числе декстрановые гели). В тонкослойной и бумажной хроматографии исследуемую смесь в жидком виде наносят на стартовую линию (начало пластинки или полоски бумаги), а затем разделяют на компоненты восходящим или нисходящим потоком элюента.

Последующее обнаружение (проявление) разделённых веществ на хроматограмме (так в этих случаях называют пластину с нанесённым на неё сорбентом или хроматографическую бумагу, на которых произошло разделение исследуемой смеси на компоненты) осуществляют при помощи ультрафиолетовой спектроскопии, инфракрасной спектроскопии или обработкой реактивами, образующими с анализируемыми веществами окрашенные соединения. Качественно состав смесей с помощью этих видов хроматографий характеризуют определённой скоростью перемещения пятен веществ относительно скорости движения растворителя в данных условиях. Количественный анализ осуществляют измерением интенсивности окраски вещества на хроматограмме. Газовая хроматография применяется для газов разделения, определения примесей вредных веществ в воздухе, воде, почве, промышленных продуктах; определения состава продуктов основного органического и нефтехимического синтеза, выхлопных газов, лекарственных препаратов, а также в криминалистике. Газовая хроматография применяется также для определения физико-химических характеристик индивидуальных соединений: теплоты адсорбции и растворения, энтальпии, энтропии, констант равновесия и комплексообразования; для твёрдых веществ этот метод позволяет измерить удельную поверхность, пористость, каталитическую активность.

Жидкостная хроматография используется для анализа, разделения и очистки синтетических полимеров, лекарственных препаратов, детергентов, белков, гормонов и других биологически важных соединений. Использование высокочувствительных детекторов позволяет работать с очень малыми количествами веществ (10−11−10−9г), что исключительно важно в биологических исследованиях. Тонкослойная и бумажная хроматография используются для анализа жиров, углеводов, белков и других природных веществ и неорганических соединений.

Глава 4. Методики определения гликолевой кислоты (спектрофотометрия, инверсионная вольтамперометрия, хроматография) Инверсионная вольтамперометрия:

Измерения проводят на полярографе ПСЛ-1 по трехэлектродной схеме: рабочий электрод — висящая ртутная капля, вспомогательный электрод — платиновый и электрод сравнения — хлорсеребряный электрод в насыщенном растворе KCl (х.с.э.). Для записи вольтамперограмм используется двухкоординатный самописец.

В работе используют растворы:

фоновый раствор — 0,1 М NaCl c pH 3;

исходные растворы металлов:

1)Cu, Cd и Zn по 10−1 г/л;

2) 10−1 г/л Pb при рН 3.

Электрохимическое накопление определяемых металлов в амальгаме ведут за счет электровосстановления при потенциале -1,1 В (относ. х.с.э.) в течение различного времени (от 20 до 100 сек). Съемку анодных вольтамперных кривых проводят в интервале потенциалов -1,1 — +0,1 В при скорости развертки потенциала 2 — 5 мВ/с и наложении квадратно-волновых импульсов с амплитудой +5 — +20 мВ.

Перед проведением измерений в течение 15 мин, а также при проведении накопления амальгамы через раствор пропускают инертный газ (аргон) для удаления из раствора растворенного кислорода. Во время съемки вольтамперограмм инертный газ пропускают над раствором.

В ячейку заливают 30мл фонового раствора с неизвестной концентрацией катионов Cu, Cd, Zn и Pb. Пропускают через раствор в течение 15 мин инертный газ, подвешивают ртутную каплю, проводят накопление амальгамы в течение установленного времени и снимают анодную вольтамперную кривую. Изменяют время накопления, подвешивают новую каплю ртути и проводят снова накопление амальгамы и снятие вольтамперограммы. Времена накопления (tn) устанавливают 20, 40, 60, 80 и 100 сек.

На полученных вольтамперных кривых определяют высоты пиков (Ip) для всех четырех определяемых металлов и строят график зависимости Ip от tn. Выбирают время накопления, соответствующее середине линейного участка зависимости Ip от tn (40 сек), и проводят съемку 3 вольтамперных кривых при этом времени накопления. Рассчитывают, какие добавки растворов определяемых металлов с концентрацией 10−1г/л нужно внести в ячейку для изменения концентрации рабочего раствора на указанную величину. Вводят рассчитанные добавки, 10 мин пропускают через раствор инертный газ и снимают еще 3 вольтамперограммы при том же времени накопления. Для каждого пика определяют средние значения высоты пика, полученные в исходном растворе и в растворе после введения добавки. Концентрации катионов в исходном растворе находят с помощью соотношения

Ip1/Ip2 = cx/(cx+c), где

Ip1 — высота пика в исходном растворе;

Ip2 — высота пика после введения в раствор добавки;

cx — концентрация катиона данного металла в исходном растворе;

c — изменение концентрации соответствующего катиона в растворе в результате введения добавки.

Вводят в ячейку вторично такие же добавки катионов металлов, пропускают инертный газ и проводят аналогичные измерения. С помощью соотношения Ip1/Ip3 = cx/(cx+2c) (где Ip3 — высота пика после введения в раствор второй добавки) также определяют исходную концентрацию в растворе ионов исследуемых металлов. Рассчитывают средние значения концентрации ионов в исходном растворе, полученные в результате расчетов после введения первой и второй добавок.

Количественное определение гликолевой кислоты в крови и моче хроматографическим методом:

Определение гликолевой кислоты производится в виде ее метильного производного. К 0,5 мл плазмы крови (или мочи) добавляют 1,0 мл метанола, содержащего 3,9 мкмоль/л (41 мг%) этоксиуксусной кислоты, использующейся в качестве внутреннего стандарта. Пробу центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. К 0,5 мл супернатанта (надосадочной жидкости) добавляют 100 мг ТМА, 0,2 мл 10% раствора аммиака и 0,1 мл иодистого метила. Пробу герметизируют и инкубируют в течение часа при температуре 800С, а затем производят определение деривата гликолевой кислоты газохроматографическим методом. Условия определения: газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором; колонка стеклянная, длиной 3,3 м, внутренним диаметром 3 мм; насадка — 10% Carbowax — 20 М на хроматоне N-AW, газ-носитель — гелий со скоростью 30 мл/мин, температура колонки — 1000С, испарителя и детектора — 1800С. Идентификацию гликолевой кислоты производят по абсолютному времени удерживания. Расчет концентрации определяемого вещества осуществляют по формуле:

C=K (H1/H2) (ммоль/л), где: Н1 — высота (или площадь) пика исследуемого вещества, мм; Н2 — высота (или площадь) пика стандарта, мм; К — поправочный коэффициент.

Экспресс-определение этиленгликоля (предшественника образования гликолевой кислоты в организме) в моче и плазме крови методом газовой хроматографии:

Условия газохроматографического определения: газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором, колонка стеклянная, длиной 1,2 м, внутренним диаметром 3 мм, насадка — Separon BD (100 мкм) или Porapak Q-S (80 — 100 мкм), газ-носитель — гелий со скоростью 45 мл/мин, температура колонки при использовании сепарона 1800С, порапака 2000С, температура испарителя 2200С, скорость движения диаграммной ленты 3 мм/мин. 2 — 3 мкл мочи или плазмы крови вводят в колонку хроматографа при указанных условиях. Чувствительность прибора устанавливается таким образом, чтобы при хроматографировании метчика — 100 мг% (16 ммоль/л) раствора гликолевой кислоты на хроматограмме регистрировался пик высотой не менее 5 см. При таких условиях исследования биожидкостей на хроматограмме фиксируются и самые низкие концентрации гликолевой кислоты, идентификация которой осуществляется по абсолютному времени удерживания, совпадающему с метчиком. Следует отметить, что при исследовании биологических объектов на хроматограммах, как правило, регистрируется фоновый пик со временем удерживания, приблизительно равным половине времени удерживания гликолевой кислоты и также не мешающий ее определению. При отрицательном результате анализа, то есть, если на хроматограмме при вышеуказанной чувствительности отсутствует пик со временем удерживания гликолевой кислоты, делается вывод о не обнаружении гликолевой кислоты в исследуемых биологических.

Инфракрасная — спектроскопия Условия анализа: инфракрасный спектрофотометр «Specord M80», диапазон волновых чисел 4000 — 650 см-1, программа управления щелью 12, время интегрирования 0,25 сек, сдвиг точки нуля 100, масштаб шкалы абсцисс 0,5, способ представления ординат — % Т. 0,5 — 1 мл водного извлечения из крови или мочи испаряют в агатовой ступке до объема капли. К полученному концентрату прибавляют небольшое количество порошка бромида калия. После перемешивания влажный порошок осторожно подсушивают под вентилятором до сыпучего состояния, таблетируют в пресс-форме (диаметр таблетки 3 мм) и подвергают спектральному исследованию.

Артеменко А. И. Органическая химия издательство «Высшая школа». М., 2003., — 680 c.

Белобородов В.Л., Зурабян С. Э., Лузин А. П., Тюкавкина Н. А. Органическая химия. М.: «Дрофа». 2002

Кн. 1. 640 с.

Березин Б.Д., Березин Д. Б. Курс современной органической химии. М.: «Высшая школа». 1999., — 768 с.

Брайнина Х.З., Нейман Е. Я., Слепушкин В. В. Инверсионные электроаналитические методы. М.: Химия, 1988., — 230 c.

Вайзман Ф. Л. Основы органической химии: Учебник пособие для вузов; Пер, с англ. Под ред.А. А. Потехина, СПб: Химия, 1995., — 463 с.

Методы работы в лабораторном практикуме по органической химии. Методические указания. Составители: Карманова Т. В., Хелевина О. Г. Иваново: ИГХТА. 1995., — 40 с.

Реутов О.А., Курц А. Л. Бутин К.П. Органическая химия. М.: Изд. МГУ. 1999. Ч. 1. 608 с.

Реутов О.А., Курц А. Л. Бутин К.П. Органическая химия. М.: Изд. МГУ. 1999. Ч. 2. 624 с.

Реутов О.А., Курц А. Л. Бутин К.П. Органическая химия. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2004. Ч. 3. 544 с.

Реутов О.А., Курц А. Л. Бутин К.П. Органическая химия. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2004. Ч. 4. 726 с.

Шабаров Ю. С. Органическая химия. М.: «Химия». 2000

Изд. 3. 848 с.

Этап титрования Оттитровано кислоты, % Объем добавленного титранта, мл Общий объем смеси в колбе для титрования, мл Состав раствора Расчетная формула pH 1 0 0 10 НОСН2СООН [H+] = √Ka co=√3,86 .10−5. 0,1=2,90 .10−3 M

pH= ½(pKa + pco)

2,9 2 50 5 15 НОСН2СООН+

НОСН2СООNa [H+] = Ka/co Vo=3,83. 10−5M

4,8 90 9,0 19,0 НОСН2СООН+

НОСН2СООNa [H+] =Ka (0,1. 10 — 0,1. 9,90)/0,1. 9,90 = 3,83. 10−7M

6,8 99,9 9,99 19,9 НОСН2СООН+

НОСН2СООNa [H+] =Ka (0,1. 10 — 0,1. 9,99)/0,1. 9,99 =3,83. 10−8M

7,8 3 100 10 20 НОСН2СООNa [OH-]=√Kbcв=11,79. 10−6M; [H+] =Kw/√Kbcв=4,09. 10−9 M и pH=14-pKb — pco 8,7 4 Избыток титранта 0,1% 0,01 20,01 НОСН2СООН+

NaOH;

[OH] =c (1/1NaOH)V (NaOH) — c (1/1 НОСН2СООН) V (НОСН2СООН)/V НОСН2СООН +VNaOH=4,997. 10−5 M

[H+]=Kw/[OH-]=2,001. 10−10 M

9,7 Избыток титранта 10% 0,1 20,1 НОСН2СООН+

NaOH;

[OH] =c (1/1NaOH)V (NaOH) — c (1/1 НОСН2СООН) V (НОСН2СООН)/V НОСН2СООН +VNaOH=4,975. 10−4 M

[H+]=Kw/[OH-]=2,010. 10−11 M

10,7 Избыток титранта 50% 15 25 НОСН2СООН+

NaOH;

[[OH] =c (1/1NaOH)V (NaOH) — c (1/1 НОСН2СООН) V (НОСН2СООН)/V НОСН2СООН +VNaOH=2,0. 10−2 M

[H+]=Kw/[OH-] =5,0. 10−13 M 12,3

ТЭ

РТ (фенолфталеин)

рТ (тимоловый синий)

Скачок титрования

Линия нейтральности

V (NaOH), мл

oттитровано НОСН2СООН,%

2 4 6 8 10 12 14 16

pH