Автоматизация лабораторной диагностики гельминтозов (экспериментальные исследования)

Паразитарные болезни остаются одной из наиболее широко распространенных патологий человека в мире. По данным Всемирного Банка Реконструкции и Развития (Инвестиции в здравоохранение, 1993) среди ведущих причин ущерба, наносимого человечеству всеми болезнями и травмами, кишечные гельминтозы занимают четвертое место. По данным Всемирной организации здравоохранения (WHO, 1996, Tropical Disease, 1993) число больных паразитозами в мире достигает нескольких миллиардов. Поэтому Всемирная организация здравоохранения (2000) призвала страны-члены этой организации существенно усилить профилактику паразитарных болезней.

В настоящее время в Российской Федерации сохраняется высокая заболеваемость паразитарными болезнями, прежде всего гельминтозами. Ежегодно в стране регистрируется более 1 млн. больных гельминтозами (Сергиев, 2002). В бывшем СССР ежегодное регистрируемое число больных паразитозами достигало 4,5 млн., что превышало число больных всеми инфекциями без гриппа о ОРВИ (Сергиев и др., 1989).

Результаты выборочных обследований и экспертные оценки свидетельствует, что реальное число больных паразитозами в России составляет более 20 млн. (Сергиев, 2001, Онищенко, 2003;). Негативное воздействие паразитарной патологии и, прежде всего, гельминтозов, на состояние здоровья граждан Российской Федерации столь велико, что этот вопрос специально рассматривался на заседании Коллегии Министерства здравоохранения России (2001), на Парламентских слушаниях в Государственной Думе (2002) и на заседании Правительственной комиссии по охране здоровья граждан (2003).

Паразитарные болезни являются причиной задержки психического и физического развития детей (Freij и др., 1979), снижают трудоспособность взрослого населения (WHO, 1995; Parasite in Korea, 1994; Pawlowski et al., 1991). Вызывая аллергизацию и иммуносупрессию организма пораженного человека (Greenwood, 1974, Greenwood и др., 1974, Nussenzweig, 1982), паразитозы снижают сопротивляемость инфекционным и соматическим заболеваниям (WHO, 1994,1996), негативно влияют на эффективность плановой вакцинопрофилактики (Лысенко и др., 1991, Рыбак, 1991). Пораженност’ь населения паразитозами за счет нередкого развития вторичного иммунодефицита (Cohen, Sadum, 1976; Jamison et al., 1993), часто приводит к более тяжелому течению сопутствующих заболеваний и вторичных инфекций (Астафьев, 1975, Бургасов и др., 1976, Сергиев, 1991).

Проблема предупреждения распространения паразитарных болезней в Российской Федерации стала чрезвычайно актуальной и требует комплексного межведомственного подхода к ее решению. С целью кардинального изменения проводимой в стране политики по борьбе с данными болезнями требуется усилить роль государства в комплексной разработке и осуществлении соответствующих мер одновременным повышением его ответственности перед гражданами за своевременность, доступность и качество оказываемой медицинской помощи (Онищенко, 2003).

В последние 5 лет объемы гельминтологических исследований в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений и бактериологических лабораториях центров Госсанэпиднадзора существенно увеличились. Однако, несмотря на рост числа исследований кардинального изменения с выявлением больных гельминтозами не произошло (Онищенко, 2001,2002). Недовыявление больных паразитозами связано кадровым дефицитом, недостаточной квалификацией работников КДЛ и значительной трудоемкостью имеющихся лабораторных диагностических методов.

Территория Центрального административного округа города Москвы характеризуется относительно низкой численностью населения по Москве, около 720 000 человек, из них 90 277 человек детского населения. Однако в Центральном округе сосредоточено наибольшее количество эпидемиологически значимых объектов и округ отличается высокой плотностью пищевых, коммунально-бытовых, детских, лечебных учреждений, научно-исследовательских институтов, учебных заведений высшего и среднего специального образования. На надзоре в отделе медицинской паразитологии находились свыше 7700 объектов, из них.

• 470 лечебно-профилактических учреждений;

• 227 детских дошкольных учреждений.

• 179 общеобразовательных учреждений.

• 13 учреждений закрытого типа.

• 59 объектов пищевой промышленности.

• 2060 объектов общ. питания, предприятий торговли.

• 3750 жилых домов.

• 28 биологических клиник научно-исследовательских институтов.

• Цирк на Цветном бульваре.

• Театр зверей «Уголок дедушки Дурова».

• Московский Зоопарк.

• 903 туристические фирмы и агентства.

• 26 декоративных прудов.

Число лиц, работающих на предприятиях, обучающихся в учебных заведениях, а также прикрепленных для медицинского обслуживания в лечебно-профилактические учреждения округа, значительно превышает численность взрослого населения округа. Общее количество декретированного взрослого населения в округе составляет 96 260 человек, 76 500 детей посещают детские учреждения. Такая насыщенность округа объектами надзора определяет выбор приоритетных направлений деятельности отдела медицинской паразитологии Центра при организации профилактических мероприятий и усиливает напряженность работы при проведении противоэпидемических мероприятий.

Согласно проведенным нами теоретическим расчетам для обеспечения надлежащего паразитологического лабораторно-инструментального контроля на объектах надзора округа в штатном расписании лаборатории отдела медицинской паразитологии Центра Госсанэпиднадзора в Центральном административном округе г. Москвы необходимо было предусмотреть бригадный принцип организации работы, состоящий из двух врачей и четырех фельдшеров — лаборантов. Фактический штат паразитологической лаборатории Центра сформирован из 3.0 ставок фельдшера-лаборанта без должности врача-лаборанта и с 1992 г. был укомплектован двумя физическими лицами. Нагрузка на одного специалиста паразитологической лаборатории в 1998;2003 гг. составляла 80 120 исследований в день.

При организации лабораторного контроля на объектах и выполнения поставленных перед службой округа задач нам необходимо было преобразовать производственный процесс путем интенсификации и повышения результативности работы.

Одним из возможных направлений эффективной диагностики гельминтозов и интенсификации производственного процесса в лаборатории могла стать автоматизация исследований. Одновременно автоматизация лабораторных исследований привела бы к снижению трудозатрат работников лаборатории на рутинные методы исследования, роботизации некоторых этапов исследования и могла способствовать повышению квалификации трудового процесса и объективизации получаемых результатов.

Учитывая изложенное, нами, начиная с 2000 года, совместно с ЗАО «Мекос» и Институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марциновского на базе паразитологической лаборатории Центра Госсанэпиднадзора в Центральном АО г. Москвы, проводились экспериментальные исследования.

Целью настоящей работы являлась разработка компьютерной автоматизированной системы микроскопической лабораторной диагностики гельминтозов, для использования в лабораториях первичного звена здравоохранения и государственной санэпидслужбы.

Для достижения поставленной цели решались следующие конкретные задачи:

1. Разработка технических требований для обеспечения автоматизации процесса микроскопирования лабораторных гельминтологических исследований;

2. Определение параметров компьютерного распознавания объектов поиска при копроовоскопических исследованиях;

3. Экспертная оценка эффективности и рентабельности работы компьютерного комплекса «МЕКОС-Ц» при работе в автоматическом режиме;

4. Формулирование технико-эксплуатационных требований программного модуля «Паразитология» и совершенствование компьютерного комплекса «МЕКОС-Ц»;

5. Испытание автоматизированной компьютерной системы лабораторного микроскопирования, снабженной программным модулем «Паразитология», при диагностике кишечных гельминтозов.

Научная новизна.

В результате проведенных научных исследований нами впервые.

1. Отработаны подходы и требования при создании автоматизированных лабораторных микроскопических диагностических систем для выявления больных кишечными гельминтозами. Стандартизирована модель для разработки алгоритма автоматизированного поиска возбудителей гельминтозов при автоматизации исследований методом формалин — эфирной седиментации.

2. Определены параметры и диагностические признаки объектов поиска при автоматизированных копроовоскопических исследованиях.

3. Разработан и введен в программу поиска дополнительный признак распознавания яиц гельминтов по признаку округлости внутренней оболочки объектов поиска.

Практическая значимость.

Создан, испытан и внедрен в практику работы паразитологической лаборатории Центра Госсанэпиднадзора и клинико-диагностической лаборатории городской больницы аппаратно-программный комплекс «МЕКОС-Ц» для автоматизированного проведения копроовоскопических диагностических лабораторных исследований, снабженный оригинальным программным модулем «Паразитология», в автоматизированном режиме его эксплуатации, обеспечивающий повышение эффективности выявления гельминтологических объектов до 91%.

Использование аппаратного комплекса обеспечивает освобождение высококвалифицированного персонала лабораторий от выполнения рутинных трудоемких и монотонных исследований.

Результаты исследований внедрены в работу паразитологической лаборатории Центра Госсанэпиднадзора в Центральном административном округе г. Москвы и клинико-диагностической лаборатории городской клинической больницы № 23 г. Москвы, а также вошли в методические указания МУ 3.2.1756−03 «Эпидемиологический надзор за паразитарными болезнями».

Положения, выносимые на защиту.

Положение первое. Использование программно-аппаратного комплекса «МЕКОС-Ц» при работе в автоматизированном режиме позволяет с высокой эффективностью диагностировать гельминтозы стандартным и рекомендованным Министерством здравоохранения и социального развития России методом формалин — эфирной седиментации, используя для выявления целевых объектов, дополнительного признака округлости внутренней оболочки яиц гельминтов в качестве основного критерия автоматического распознавания.

Положение второе. Использование программно-аппаратного комплекса «МЕКОС-Ц» позволяет вдвое увеличить пропускную способность паразитологической лаборатории за счет сокращения времени исследования микроскопического препарата. Применение его целесообразно при проведении массовых профилактических обследований населения или «группы повышенного риска».

Апробация работы/.

Основные положения работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях, посвященных 80-летию должности помощника санитарного врача в г. Москве (Москва, 2001) — 125-летию должности санитарного врача в г. Москве (Москва, 2002) — 80-летию кафедры инфектологии ММА им. И. М. Сеченова «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии» (Москва, 2003)-роли клинической микробиологии в профилактике внутрибольничных инфекций в Москве (Москва, 2004).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ и 2 работы приняты к публикации.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав, выводов, списка литературы. Объем диссертации 91 лист машинописного текста, включая 19 рисунков, 11 таблиц.

Список литературы

включает 50 отечественных и 46 зарубежных источников.

выводы.

1. Программный модуль «Паразитология» создан на основе Оригинального алгоритма автоматизированного микроскопирования, включающего разработку стандарта для автоматизированных лабораторных исследований на гельминтозы с использованием формалин — эфирного метода седиментации. Специфические параметры поиска потенциальных объектов по критерию округлости внутренней оболочки яиц гельминтов, позволяют увеличить эффективность обнаружения пропагативных форм возбудителей гельминтозов с 39% до 91%, т. е. в 2.3 раза.

2. Оптимальными величинами размеров шага при управлении маршрутом движения столика микроскопа программно-аппаратного комплекса «МЕКОС-Ц» для обнаружения яиц гельминтов разного видового состава являются XY= 4 мкм, Z=0,66mkm.

3. Время исследования одного препарата в автоматическом режиме использования программно-аппаратного комплекса «МЕКОС-Ц», укомплектованного программным модулем «Паразитология», составляет 13 минут, что позволяет интенсифицировать производственный процесс и увеличить пропускную способность паразитологической лаборатории в 2 раза.

4. Наиболее целесообразно и экономически обосновано использование программно-аппаратного комплекса «МЕКОС-Ц» как скринингового метода при проведении массовых профилактических обследований на гельминтозы.

Производительность работы аппаратно-программного комплекса с модулем «Паразитология» составляет 32 проб фекалий на выявление яиц гельминтов в день, что в 2 раза больше плановой нагрузки на одну ставку лаборатории. При этом достигается высвобождение высококвалифицированного персонала для проведения других видов исследования и экспертных работ.

5. Программно-аппаратный комплекс «МЕКОС-Ц» позволяет архивировать и сохранять для ретроспективного просмотра галереи выявленных паразитарных объектов. Фототека препаратов с изображениями возбудителей гельминтозов может быть использовано в качестве наглядного пособия в практической работе лабораторий, а также в процессе обучения студентов на додипломном уровне и в послевузовской подготовке кадров лабораторных работников.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Диссертационная работа «Автоматизация лабораторной диагностики гельминтозов (экспериментальные исследования)» посвящена актуальной проблеме. Современное развитие диагностики в медицине идет по пути концентрации, укрупнения многопрофильных центров, стандартизации и автоматизации исследований.

Необходимость этой работы была продиктована практическими задачами организации работы центров.

Госсанэпиднадзора и клинико-диагностических лабораторий лечебных учреждений по обследованию на кишечные паразитозы декретированных контингентов населения, коллективов детских учреждений.

В настоящее время в системе государственного санитарно-эпидемиологического надзора по стране внедряется в повседневную практическую работу метод формалин — эфирного осаждения. По данным Центра Госсанэпиднадзора в. ЦАО г. Москвы среднее число анализов в период с 1996 г. по 2000 г. варьировало от 70 -80 в день, достигая при обследовании больших коллективов более 100. При этом не снимаются и не уменьшаются другие задачи службы паразитологов, требующие микроскопирования: исследования на энтеробиоз, санитарно-паразитологические исследования воды, почвы, овощей и др.

Отечественный рынок приборов, позволяющих ускорить и автоматизировать микроскопию, в эти годы был представлен прибором «МЕКОС-Ц». Аппаратно-программный комплекс был разработан на основе отечественного микроскопа «МИКМЕД-2», модернизированного в видеомикроскоп и снабженного компьютером. Такие приборы предлагаются для различных tобластей микроскопии и требуют дальнейшей адаптации к конкретным задачам. На этой стадии прибор поступил в лабораторию отдела медицинской паразитологии Центра Госсанэпиднадзора в ЦАО г. Москвы, где впервые нами была проведена модернизация прибора, разработаны программа поиска и распознавания возбудителей паразитозов, а также критерии экспертной оценки эффективности метода детектирования по отношению к различным возбудителям паразитозов. На основании полученных результатов аппарат был нами адаптирован к требованиям и задачам лаборатории медицинской паразитологии.

На начальном этапе испытания прибора было показано, что работа в режиме ручного передвижения препарата существенно облегчала работу микроскописта, снижала зрительное напряжение. Компьютерная программа позволяла разделить во времени микроскопию препаратов и дальнейший контроль, <. оценку или консультации. Однако не был решен вопрос существенного высвобождения времени и оператор оставался i привязанным" к микроскопу.

В результате экспериментальных исследований аппаратный комплекс нами впервые был модернизирован за счет автоматического движения столика с препаратом. Это потребовало разработки и включения в программу параметров маршрута движения столика и автоматизации фокусировки микроскопа. Кроме того, в программу были введены параметры определения формы и размеров объектов поиска. На первом этапе исследований в основу распознавания пропагативных форм возбудителей паразитозов был заложен физико-химический показатель разности преломления светового потока. Испытания проводились на препаратах, включающих 5 видов яиц гельминтов I и 4-х видов цист простейших. В начальном этапе были t использованы препараты нативных мазков фекалий. Это было вызвано необходимостью изучения диагностических возможностей прибора при различной плотности загрязнения полей зрения. В дальнейшем фактически сравнивались два метода обогащения: метод Калантарян и формалин — эфирного осаждения. Оба метода достаточно трудоемки. Метод формалинэфирного осаждения намного более эффективен, однако, использует токсичные ингредиенты. На этапе приготовления препаратов под вытяжной системой пары эфира и формалина в основном улетучиваются. На этапе просмотра препаратовконтакт микроскописта с формалином и остатками эфира — более длительный и тесный. Поэтому автоматизация и ускорение процесса микроскопии имеет также санитарно-гигиенические аспекты. Контролем, как уже было сказано выше, служили коллекционные препараты 5 видов яиц гельминтов, отдельно или в смеси.

При автоматизированном скрининге коллекционных 4 препаратов эффективность поиска составила 91%, время просмотра — такое же, как при традиционной микроскопии. При диагностике яиц гельминтов по методу Калантарян времени требовалось почти в 3 раза больше, чем при работе в визуальном режиме микроскописта, а число ложноположительных находок возросло почти в 2 раза. Одной из причин этого является то, что метод Калантарян использует концентрированный солевой раствор, вызывающий в заранее приготовленных препаратах кристаллизацию, затрудняющую просмотр. Поэтому результаты скрининга этих препаратов значительно хуже и дальнейшие этапы модернизации и программирования аппаратного комплекса «МЕКОС-Ц» проводились на препаратах, приготовленных по методу формалин — эфирного осаждения. При автоматизированном скрининге препаратов, подготовленных методом формалин — эфирного осаждения, эффективность работы аппаратного комплекса составила 27.6%, в 1.8раз выше результатов автоматизированного микроскопирования препаратов, приготовленных по методу Калантарян. Таким образом, экспериментально был установлен стандартный метод при автоматизации лабораторной диагностики кишечных паразитозов.

Однако число ложноположительных находок при автоматизированном скрининге препаратов формалин-эфирного осаждения было слишком высоким и достигало 72.4%. Как видно, результаты скрининга на этом этапе разработки аппаратного комплекса не были удовлетворительными. Они были бы приемлемы только в случаях интенсивной инвазии гельминтами и простейшими.

Для снижения ошибок распознавания объектов паразитарной природы в программу автоматизированного поиска яиц гельминтов нами были внесены изменения. Впервые критерием детектирования целевых объектов был определен признак округлости контура внутренней оболочки яиц гельминтов. После корректировки программы и отработки параметров поиска яиц гельминтов в препаратах, приготовленных методом формалинэфирного осаждения, эффективность работы аппарата возросла до 79.5%. Среднее время, затрачиваемое на один препарат, сократилось на 2 минуты.

При разработке программы необходимо было также определить оптимальный маршрут автоматического движения передвижного столика микроскопа при минимальных затратах времени и без снижения эффективности поиска. От параметров маршрута зависела работа видеокамеры, так как часть объектов могла не опознаваться при попадании на границы полей зрения. Экспериментально нами был рассчитан оптимальный шаг передвижения столика: XY=4mkm, Z=0,66mkm. Эффективность автоматизированного поиска комплекса при этих параметрах увеличилась до 91%.

Таким образом, адаптированный нами для целей паразитологии аппаратный комплекс «МЕКОС-Ц» и разработанная программа «Паразитология» позволяет:

• уменьшить затраты времени на проведение анализа в среднем на 13 минут;

• снизить нагрузку на специалистов, повысить интенсивность труда и пропускную способность лаборатории в 2 раза;

• снизить контакт оператора с материалом, содержащем вредные для здоровья ингредиенты;

• освободить лаборанта от монотонной работы просмотравозможность разделения во времени оценки и контроля галереи возможных объектов паразитарной природы, сохраняющихся в фототеке компьютера;

• провести демонстрацию и возможную консультацию, не сохраняя первичный биологический материал и не повторяя этапа подготовки препарата;

• архивировать результаты исследований, документировать и предъявлять их в случае необходимости;

• фототека находок является уникальным пособием для обучения специалистов.

В данной работе нами были предприняты попытки к изучению и практическому применению современных технологий в паразитологических лабораториях, были получены стабильные результаты, которые позволят достойно решать актуальные проблемы обеспечения качества и безопасности диагностической работы и рационального использования интеллектуального потенциала кадров паразитологических лабораторий.