Изучение взаимосвязи полиморфизма систем групп крови и N-ацетилирования с риском развития рака прямой кишки и с целью индивидуализации терапии

Частота заболеваемости той или иной патологией в разных популяциях различна, и это отличие связано не только с различными экологическими и социальными условиями, но также обусловлено генетическими разл’ичиь’ми, приводящими к вариабельности в метаболических параметрах [Пирузян J1.A., 2004; Пирузян Л. А. и соавт., 2004; Пирузян А. Л. 2005]. Такие метаболические отличия зачастую могут быть обусловлены однонуклеотидными заменами (SNP) в кодирующих последовательностях генов, что приводит к модуляции функционирования белкового продукта. Такими модуляциями могут быть: увеличение, снижение или полное отсутствие активности белка. Определение значения отдельных генов, их полиморфизмов и вариаций в проявлении индивидуальных фенотипов человека позволит приблизиться к пониманию биологической сущности заболеваний, а получаемые при таком подходе данные позволят выделять группы риска развития исследуемой патологии. Заболевание может развиваться в случае неблагоприятного сочетания полиморфных гейов, вклад которых в развитие патологического процесса будет различным [Алтухов Ю. П. Курбатова O. JI" 1984: Жукова О. В. с соавт. 2005]. При этом следует принимать во внимание и индивидуальный полиморфизм генов, продукты которых могут и не иметь прямого отношения к данной патологии. А именно, индивидуальные генетические особенности организма, определяющие кинетику метаболических превращений лекарственных препаратов. канцерогенов окружающей среды, индустриальных и пищевых источников.

Рак прямой кишки (колоректальный рак) по распространенности и причине смертности населения занимает одно из первых мест среди злокачественных опухолей во многих экономически развитых странах. Заболеваемость этой’форХюй рака стоит на втором месте после рака легких у мужчин и рака молочной железы у женщин, а по уровню смертности эта патология находится после рака легких, опережая опухоли желудка, предстательной железы и опухоли всех других локализаций. Ежегодно в мире регистрируется около 800 ООО больных раком этой локализации и 440 000 смертей от этого заболевания. Рост заболеваемости наблюдается и в России: в 1980 году злокачественные образования этой локализации были диагностированы у 16 человек на 100 000 населения, а в 2000 году этот показатель приблизился к 25. Проблема ранней диагностики опухолевого процесса одна из насущных в современной онкологии. Рост заболеваемости и смертности, скудная симптоматика на ранней стадии заболевания, сходство ее с различными заболеваниями толстой кишки, поздняя обращаемость пациентов за квалифицированной медицинской помощью являются определяющими факторами того, что 30−40% пациентов в последующем подвергаются радикальному лечению. В связи с этим, актуальными являются исследования, посвященные поиску и идентификации генетических факторов риска этой патологии с целью разработки новых скрининговых программ профилактики и донозологической диагностику, а также индивидуального подбора лекарственных препаратов в клинике.

Следует подчеркнуть, что для определения фенотип-специфичных генов заболевания, необходимо применять генетический анализ к различным клиническим группам больных, при этом клинический фенотип каждого пациента должен быть охарактеризован досконально. В связи с этим, разработка новых подходов в допозологической диагностики на основе анализа клинйческих, биохимических и генетических характеристик больных является важной медико-генетической задачей.

В планируемом исследовании предполагается разработать подходы донозологической диагностики рака прямой кишки на основе сравнительного анализа клинических, биохимических и генетических характеристик здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки. Исходя из цели исследования, определены следующие задачи:

— Провести сбор информационного и клинического материала у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки:

— Создать компьютерный регистр больных раком прямой кишки на основании информационного материала ИИК (индивидуальная информационная карта);

— Определить особенности распространения классических генетических маркеров (ABO, Rhesus. MN. Kell) у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки:

Провести сравнительный анализ результатов фенотипировгчшя. и генотнпирования по полиморфизму N-ацетилирвоания в московской выборке волонтеров;

— Провести анализ ассоциации полиморфных вариантов гена NAT2 (N-ацетилтрансферазы 2) с риском развития рака прямой кишки;

— Изучить особенности клинических проявлений у пациентов с различным генетическим полиморфизмом системы групп крови и ацетилирования.

— разработать и предложить новый подход для донозсшогической диагностики рака прямой кишки, основанный на анализе метаболического и генетического статуса индивидуумов.

Научная новнзна и практическая значимость работы. Показало. 'по разработанные и апробированные нами критерии Индивидуальной информационной карты (ИИК). позволяют получать необходимую информацию для индивидуального описания пациента с раком прямой кишки. Впервые показано, что при определении риска развития рака прямой кишки следует использовать совокупность генетических маркеров, основанных на полиморфизме систем групп крови и ацетилирования. Продемонстрированы возможности подхода, основанного на интеграции клинических обследований и результатов молекулярно-генетических исследований, выявлять группы риска развития онкологической патологии ректального отдела кишечника. Установленное разнообразие среди пациентов с раком прямой кишки по генотипу и фенотипу NAT2 с доминированием медленного N-ацетилирования (NAT2*5/*5) позволит индивидуализировать и оптимизировать фармакологическую и лучевую терапию с учетом известной более высокой чувствительности медленных N-ацетиляторов к побочному действию лекарств и канцерогенов.

Выводы.

1. На основании результатов анализа клинических характеристик пациентов с раком прямой кишки показано, что для создания баз данных могут быть использованы разработанные и апробированные нами критерии Индивидуальной информационной карты (ИИК). которые позволяют получать необходимую информацию для индивидуального описания пациента с раком прямой кишки.

2. Выявлены особенности в распространении классических генетических маркеров системы групп крови у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки. Отмечено снижение частоты генов MN системы MNs и повышение частоты гена В системы АВО и частоты гомозигот ММ системы MNs в группе пациентов по сравнению с контролем.

3. На основании сравнительного анализа результатов фенотипнрования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования в московской выборке показано, что фенотип ацетилирования может быть экстраполирован из результатов генотипирования гена NAT2.

4. Выявлены особенности в распространении частот аллелей и генотипов гена NAT2 у практически здорового населения и пациентов с раком прямой кишки в московской выборке. Показано статистически достоверное преобладание у пациентов с раком прямой кишки группы генотипа NAT2*5/*5 по сравнению с контролем.

5. Показано, что совокупность генетических маркеров, основанных на полиморфизме системы групп крови и ацетилирования (сочетание генетических маркеров группы крови В. локуса ММ и генотипа NAT2*S/*S), может быть использована для выявления групп риска предрасположенности к раку прямой кишки.

6. Установлено, что пациенты с раком прямой кишки, имеющие два генетических маркера риска развития патологии или генотип NAT2*5/*5, могут быть включены в группу риска более агрессивного прогрессирования опухолевого процесса (метастазирование), а также вероятного формирования нового опухолевого заболевания.

Установленное разнообразие среди пациентов с раком прямой кишки по генотипу и фенотипу NAT2 с доминированием медленного N-ацетилирования (NAT2*5/*S) позволит индивидуализировать и оптимизировать фармакологическую и лучевую терапию с учетом известной более высокой чувствительности медленных N-ацетиляторов к побочному действию лекарств и канцерогенов.

Заключение

.

Выявление вариаций последовательностей генома в генофондах человеческих популяций, выяснение их значимости и вклада в проявление фенотипических признаков, и. в частности, в предрасположенности к развитию определенных заболеваний, или в чувствительности к определенному лекарственному препарату может послужить основой генетической и метаболической паспортизации индивидуумов для медицинских целей [Пирузян JI. A, 1990; 2004; 2005]. Самым важным, иа наш взгляд, в таких исследованиях является интеграция клинических обследований и результатов лабораторных исследований. Для такой интеграции необходимым условием является создание стандартизированных (унифицированных) баз данных информационного материала и результатов лабораторных исследований о пациентах с патологией.

На основании результатов анализа клинических характеристик пациентов с раком прямой кишки показано, что для создания баз данных могут быть использованы разработанные ранее [Пирузян Ан.Л., 2005] и апробированные нами критерии Индивидуальной информационной карты (ИИК). которые позволяют получать необходимую информацию для индивидуального описания индивидуумов [Жукова О.В. и др. 2005; Пирузян Ан.Л. и др., 2005; Голденкова-Павлова И.В. и др. 2006]. Помимо этого критерии позволяют: учитывать наследственную предрасположенность к заболеванию, факторы окружающей среды и образ жизни индивидуумаполучать унифицированные данные, которые можно легко формализовать, и создавать на их основе стандартизированные (унифицированные) базы данных о патологии. В нашем исследовании апробированы критерии ИИК. разработанной ранее и модифицированной нами для сбора информационного материала о пациентах с раком прямой кишки. Показана возможность предложенной ИИК для создания унифицированной базы данных о пациентах, а также для выявления общих, групповых и индивидуальных особенностей исследуемой патологии. Пополняя и используя базу данных, полученную с помощью унифицированных критериев ИИК. в дальнейшем возможна разработка скрининговых программ, направленных на профилактику патологий. Кроме этого. ИИК с унифицированными критериями является корректным инструментом для эпидемиологических исследований и генетического анализа патологии. Следует особо подчеркнуть, что. по нашему мнению, использование совокупности унифицированных критериев для описания пациента позволит проводить сравнительный анализ экспериментальных данных, получаемых различными исследователями, как в области изучения патогенеза и генетики патологии, так и в области индивидуального ответа пациента на применение лекарственных препаратов.

Проведенный анализ клинического материала позволил выявить особенности в распространении классических генетических маркеров системы групп крови у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки. Так. в группе пациентов чаще, чем можно было ожидать, исходя из свойств московского генофонда, представлены фенотипы ММ системы MNs и В системы АВО. Судя по значению критерия сопряженности у} для данного расчета (Таблица 3.1.) отмеченное выше смещение пациентов от групповых свойств АВО и MNs населения Москвы статистически достоверно. Фактором, который обусл*влюает это достоверное отклонение, может служить признак, который положен в основ)' формирования группы — развитие рака прямой кишки. На основании этих результатов, иммуногенетические маркеры системы АВО и MNs предложены в качестве генетических маркеров для выявления индивидуумов с повышенным риском развития рака прямой кишки.

Как уже отмечалось выше, соотношение быстрых и медленных ацетиляторов значительно варьирует в популяциях с различным этническим и географическим происхождением [Радкевич JI.A. и др. 2005; Mohrenweiser H.W. et al. 2003]. Индивидуальные и этнические различия в ацетиляторной способности полиморфной NAT2 оказывают влияние на терапевтический эффект и наличие побочных эффектов некоторых используемых в клинике лекарств [Пирулн Г: Л., 1990: 2004: Пирузян J1.A. и др., 2003, 2005; Johnson J., 2003]. Большинство данных в современной литературе касаются полиморфизмов в популяциях европеоидов, афроамериканцев, но очень мало известно о других этнических группах. Следует отметить, данные по распределению фенотипов ацетилирования. характерных для населения России, отсутствуют. Есть одиночные сведения по некоторым регионам по определению генотипа NAT2 для выявления ассоциаций полиморфизмов гена NAT2 с рядом патологий [Артамонов В.В. и др., 2004; Вавилин В. А. и др., 2002; Викторова Т. В. и др., 2003; Макарова О. В. и др., 2003; Пирузян JI.A. и др. 2004; Радкевич Л. А. и др., 2005; Grant D. М. et al., 1997; Hamasaki Т. et al., 2003; Stattery M.L. et al., 1998; Vineis P., Martone Т., 1998]. При этом, в основном, исследуются описанные в литературе мутации гена NAT2, и не учитывается тот факт, что в российской популяции могут быть уникальные генотипы NAT2. данных о которых не имеется в мировой литературе. Следует отметить, что N-ацетилтрансфераза проявляет типичный генетический полиморфизм, поскольку быстрый или медленный фенотип коррелирует с определенным генотипом NAT2. который обусловлен мутациями в нуклеотидной последовательности этого гена.

При этом, в литературе нет данных о взаимосвязи между генотипом и фенотип N-ацетилирования для российской популяции в целом, и для московского региона, в частности. Исходя из вышесказанного, был проведен сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования. Проведенные исследования показали, что соотношение быстрых и медленных ацетиляторов (БА и МА). определяемое с использованием двух подходов, достоверно не отличается: 46% (при фенотипировании) и 45% (при генотипировании). Показано, что абсолютные значения скорости ацетилирования варьируют в широких пределах, как быстрых, так и медленных ацетиляторов. Продемонстрировано, что фенотип ацетилирования может быть экстраполирован из результатов генотипирования гена NAT2. .

В последние годы предрасположенность людей к различным заболеваниям, включая онкологические, связывают с индивидуальной активностью генетически детерминированной системы декотсикации ксенобиотиков, прежде всего с N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2). Взаимосвязь между индивидуальной активностью N-ацетилтрансферазы и развитием патологий не случайна. Она обусловлена тем. что в результате разной активности фермента происходит образование генотоксических промежуточных метаболитов, которые могут индуцировать развитие патологий, и. прежде всего, онкологических. Следует отметить, что сведения о роли NAT2 в предрасположенности к раку прямой кишки в литературе противоречивы. В связи с изучение прогностического значения фенотипа ацетилирования в развитии рака прямой кишки, был проведен анализ клинического материала, полученного от пациентов. Проведенный анализ позволил выявить особенности в распространении частот аллелей и генотипов гена NAT2 у практически здорового населения и пациентов с раком прямой кишки в московской выборке. Статистически достоверно показано преобладание у пациентов с раком прямой кишки группы генотипа NAT2*5/*5 и снижение частоты генотипов NAT2*4/*5 по сравнению с контролем.

Таким образом, была установлена роль изученных полиморфных локусов систем ABO, MNs и NAT2 человека как факторов, обуславливающих риск развития рака прямой кишки. Следует отметить, что статистический характер исследования имеет свои ограничения: изученные полиморфные признаки могут рассматриваться только как факторы риска в статистическом смысле, поскольку, проявля. я се (-я в достаточно большом ряду наблюдений, на достаточно большой когорте пациентов, в каждом конкретном индивидуальном случае они могут быть использованы лишь для вероятностного прогноза риска развития патологии. Ценность такого прогноза всецело обусловлена его вероятностью [Рычков Ю.Г. и др. 1985]. В среднем для каждого из отдельных признаков (фенотипов) — группа крови В, генотип ММ и генотип NAT2*5/*5 — вероятность его проявления как фактора риска развития рака прямой кишки составила в среднем 26% (рис. 3.20), что весьма весомо для больших контингентов людей, и вместе с тем весьма ориентировочна для индивидуального случая. Это побудило нас рассмотреть сочетанный эффект всех признаков и исследовать их как совокупность маркеров риска. Для этой цели был использован подход, основанный на интеграции клинических обследований и результатов генотипирования. В работе Рычков Ю. Г. и соавторами [1985] схожий подход, основанный на применении системы генетических маркеров человека, был использован для разработки прогноза риска гнойных осложнений раневого поражения. Результаты нашего исследований подтверждают необходимость использования системы маркеров и позволяют заключить следующее: при определении риска развития рака прямой кишки следует использовать совокупность генетических маркеров, основанных на полиморфизме системы групп крови и ацетилирования. Прогностическая ценность выявленной за счет анализа совокупности генетических маркеров оказалась намного выше, чем у отдельных признаков (маркеров) в нее входящих. Вероятность того, что совокупность двух и трех генетических маркеров проявит себя как фактор риска развития рака прямой кишки, составила 69% против 31% для отдельного признака (рис. 3.23). Это весьма весомо не только для больших контингентов больных, но и в индивидуальном случае. Помимо этого, вероятность того, что совокупность двух и трех генетических маркеров проявляют себя как факторы более агрессивного прогрессирования опухолевого процесса (метастазирование). а также вероятного формирования нового опухолевого заболевания, составила 76% против 24% для отдельного признака. Следует также подчеркнуть, что 2/3 пациентов с раком прямой кишки, у которых выявлены такие патологические изменения как образование опухоли, метастазы, гиперплазии, имели генотип NAT2*S/*5. Знание того, что совокупность генетических маркеров и генотип NAT2*5/*5 могут определять метастазирование и формирование нового опухолевого ьроць-са. побудит клиницистов выявлять эти генетические маркеры у пациентов, тем более что определение их не требует больших затрат труда, времени и средств.

Наиболее перспективный путь дальнейшего развития предложенного подхода для выявления генетических факторов риска развития рака прямой кишки. а также, вероятно, и других патологий, связан с пополнением набора генетических маркеров риска, чтобы свести фактор случайности и непредсказуемости к пренебрежительно малой величине.

Таким образом, в работе разработан подход, основанный на интеграции клинических обследований и результатов молекулярно-генетических исследований (выявление генетического полиморфизма), и экспериментально подтверждена возможность такого подхода, выявлять группы риска развития онкологической патологии.