Идентификация и характеристика новых хромосомных факторов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у Staphylococcuc aureus

1.1 Антибиотики и возникновение резистентности.

Применение антибиотиков и химиотерапевтических препаратов для лечения бактериальных инфекций и патогенных возбудителей заболеваний было начато в 1902 году в связи с открытием различной аффинности красителей по отношению к бактериальным клеткам и клеткам млекопитающих. Это открытие было сделано немецким врачом Паулем Эрлихом (Нобелевская премия 1908 года). В 1928 году английский микробиолог Александр Флемминг обнаружил антибактериальное действие плесневого грибка Penicillum potatum (Нобелевская премия 1945 года), в 1939 году Флорей и Чайн выделили пенициллин — действующее вещество гриба Penicillum (Нобелевская премия 1945 года совместно с А. Флеммингом), а в 1941 году было налажено производство пенициллина в коммерческих целях.

Начиная с того времени и за последующие годы, стали известны более сотни новых антибактериальных веществ. Эти вещества делятся на группы в соответствии со спектром их действия, их происхождением, их мишенями, их химическим составом и их электрическим зарядом.

Уже к началу эры химиотерапии был замечен негативный феномен применения антибиотиков: под действием селективного давления бактерии различными путями могут приобретать устойчивость (или резистентность) и становиться, таким образом, нечувствительными к воздействию антибактериальных агентов.

Первый случай бактериальной устойчивости был замечен в 1944 годутогда был обнаружен штамм Staphylococcus aureus (S.aunus), который мог расщеплять пенициллин за счет наличия у него фермента бета-лактамазы (53). Под воздействием бета-лактамазы происходит гидролиз пенициллинового кольца, и пенициллин превращается в пенициллиновую кислоту, которая не обладает антибактериальнами свойствами. Случаи устойчивости к пенициллину резко участились в последующие десятилетия до тех пор, пока практически все клинические изоляты стафилококков не стали устойчивыми к пенициллину.

В промежутке с 1940 по 1950 годы была обнаружена устойчивость к другим антибактериальным веществам (часто в сочетании с пенициллиновой). Развитие мультиустойчивости в значительной степени затрудняет лечение и на сегодня является большой клинической проблемой. Для того, чтобы решить проблему устойчивости и мультиустойчивости, особенно важно иметь точную информацию об отдельных факторах устойчивости, ее возникновении и генетической основе.

Взаимодействие бактерий и антибиотиков может быть рассмотрено по двум различным аспектам:

1. Как антибиотики воздействуют на бактерии? (механизмы, мишени, физиологические последствия).

2. Какие стратегии вырабатываются бактериями для защиты от антибиотиков? (приобретенная устойчивость).

Исследования показали, что и действие антибиотиков, и бактериальный ответ могут принимать самые различные формы. На сегодняшний день наука имеет в распоряжении целый ряд методов и средств для детального изучения процессов в области бактериальной устойчивости. Важнейшая информация о бета-лактамных антибиотиках, их действии, о возникновении устойчивости у S. aureus и методах, применяемых для ее изучения, будет кратко описана в литературной части данной работы.

5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Посредством транспозонового мутагенеза были сконструированы инсерционные мутанты с измененной устойчивостью к бета-лактамам.

Были получены как инсерции одного транспозона, так и инсерции всей плазмиды.

Изменения резистентности или метаболизма не были вызваны непосредственной инактивацией СПБ-генов.

Инсерции происходили в различных фрагментах генома. Была получена одна инсерция вблизи и одна в /етАВ-регионе. Дальнейшие инсерции были локализованы в ?>ш1-А, 8та1-В и Бта!-К фрагментах.

Кроме одной инсерции в^{стАВ-регионе,} все остальные инсерции не были до сих пор идентифицированы.

Были обнаружены новые, до сих пор не опубликованные Бта1-фрагменты, величиной 16 кб, 20.5 кб (двойная полоса) и 21 кб.

Фенотипические проявления инсерций зависели от штамма и в наиболее сильно экспримировались в тес-резистентном генетическом фоне ВВ270, особенно при инсерции в неизвестном гене вблизи/етАВ-региона.

При некоторых инсерциях наблюдали рестрикционный полиморфизм, вызванный вторичными структурными изменениями.

Одна из инсерций инактивировала предположительный регулятор цитохрома, при этом это был затронут рост мутантов, устойчивость к бета-лактамам и к аминоглюкозидам.

6. РЕЗЮМЕ.

Применение антибиотиков и химиотерапевтических препаратов для клинического лечения бактериальных инфекций привело уже к началу эры антибиотиков к развитию устойчивых бактерий. До сегодняшнего дня постоянно возрастало распространение мультирезистентных стафилококков, так что большинство стафилококковых штаммов сегодня устойчивы по отношению к почти всем применяемым в клинике классам антибиотиков. На сегодняшний день для лечения подобных инфекций мультирезистентных стафилококков еще можно использовать относительно токсичные и тяжело переносимые гликопептидные антибиотики (например, ванкомицин). Однако поскольку уже известны устойчивые к ванкомицину лабораторные штаммы, поиск новых потенциальных мишеней для антибиотиков имеет не только теоретическое, но и клиническое значение. Поиск новых антимикробных соединений требует также знаний о возникновении резистентности, механизмах и возможных влияющих факторах.

В этой работе исследовались новые факторы устойчивости к бета-лактамам в стафилококках посредством транспозонового мутагенеза. Посредством этой техники и ранее были локализованы в хромосоме и фенотипически охарактеризованы несколько факторов резистентности (гены резистентности или вспомогательные факторы). Инактивация этих факторов более или менее негативно отражалась на соответствующих резистентностях. Однако до сих пор соответствующие исследования устойчивости к бета-лактамам у Staphylococcus aureus проводились лишь в известном штамме NCTC8325, а для мутагенеза использовали исключительно транспозон Тп557.

Целью этой работы было посредством транспозонового мутагенеза найти дальнейшие, до сих пор неизвестные стафилококковые факторы (также новые yew-факторы, «factors essential for expression of methicillin-resistance»), которые влияют на устойчивость к бета-лактамам. Чтобы достигнуть этой цели, для транспозонового мутагенеза был использован вместо обычного штамма NCTC8325 другой генетический фон (штамма SG511-Berlin). Транспозоновый мутагенез проводили посредством двух различных транспозонов: Тп551 и дополнительно Тп917.

При этом наблюдались, как инсерции одного транспозона, так и плазмиды (полностью или частично). Теоретическая вероятность инсерции плазмиды известна из литературы, однако до сих пор ей уделялось мало внимания. У одного из таких мутантов (Q4) часть плазмиды инсерировала даже дважды. Подобное событие является крайне редким и до сих пор еще не было описано.

При селекции мутантов искали прежде всего инсерции в кодирующих или регулирующих последовательностях для пенициллинсвязывающих белков (мишени бета-лактамов). Поэтому инсерционные мутанты были селекционированы на редуцированную резистентность по отношению к четырем бета-лактамам, который предпочтительно связывают отдельные СПБ. После отбора были идентифицированы 9 инсерционных мутантов штамма SG511 с редуцированной устойчивостью к бета-лактамам. Однако вопреки отбору на СПБ-специфических бета-лактамах, наблюдаемые изменения резистентности или метаболизма в полученных мутантах не были вызваны непосредственной инактивацией СПБ-генов.

В этой работе был установлен парадоксальный эффект бета-лактамазы на устойчивости к бета-лактамам: положительные по бета-лактамазе штаммы указывали слабое, но воспроизводимое повышение чувствительности к цефокситину в 1ЧСТС8325-штаммах.

Было проверено, не были ли полученные инсерции в штамме ВВ255 (аналог NCTC8325) ранее описаны, и исследовано, как эти инсерции влияют на устойчивость к метициллину на резистентном генетическом фоне ВВ270. Фенотипические проявления инсерций было четко зависимы от штамма, и наиболее сильно выражены в тес-резистентном генетическом фоне ВВ270. Транс дукция в гетерологичный штамм и вторичные структурные изменения привели при некоторых инсерциях к рестрикционному полиморфизму.

Девять инсерций были картированы на хромосомной карте стафилококков в Smal-A, Smal-B и Smal-K фрагментах. Кроме того, как в мутантах, так и в контролях были обнаружены новые до сих пор неопубликованные Smal-фрагменты величиной 16 кб, 20.5 кб (двойная полоса) и 21 кб. Одна инсерция (05) была локализована вблизи промотора. Следующая инсерция (03) оказалась уже известной инсерцией 2 003 в /етАВ-регионе, все другие инсерции были идентифицированы как новые. Одна из них (010) была локализована вблизи /етАВ-региона. Эта инсерция радикально снижала устойчивость к бета-лактамам специально на тес-положительном генетическом фоне ВВ270. Неизвестно, участвует ли этот новый fem-фактор в биосинтезе клеточной стенки, подобно всем до сих пор охарактеризованным /em-факторам, так как производная последовательность протеина не показала никакой сигнификантной гомологии с уже известными последовательностями белков.

Дальнейший инсерционный мутант (Об) показал ослабленный рост, причиной которого стала, вероятно, инактивация последовательности предположительного регулятора цитохрома.

В этой работе впервые было показано, что существуют другие, несвязанные с биосинтезом клеточной стенки факторы, которые могут сходным образом влиять на устойчивости к бета-лактамам: изменения устойчивости к бета-лактамам могут, очевидно, быть также вызваны инактивацией в гене белка, регулирующего цитохром. Это представляет полностью новый механизм устойчивости к бета-лактамам. Вследствие прерывания предположительной последовательности регулятора цитохрома была, с одной стороны, затронута устойчивость к бета-лактамам, а с другой стороны, чувствительность к аминоглюкозидным антибиотикам уменьшилась в два раза. У этого мутанта с нарушенным ростом был, очевидно, нарушен общий транспортный механизм. До сих пор не было сообщений о возможном влиянии цитохрома на развитие резистентности у S. aureus.

В этой работе было показано, что на чувствительность к бета-лактамам при определенных обстоятельствах могут влиять условия роста (например, скорость роста) и анаэробные условия.

Всего 7 новых факторов данной работы должны были быть рассмотрены как дальнейшие /еш-факторы. Большинство этих факторов, вероятно, являются общими регулирующими факторами клеточного метаболизма, которые непосредственно не связаны с резистентностью. В этом случае спорно, можно ли именовать такие гены факторами резистентности (концепция/em-факторов), так как они могут охватывать совершенно различные аспекты клеточного метаболизма, и их воздействие на устойчивость к антибиотикам могло бы косвенно отражать последствия других изменений.

Вновь открытые в данной работе семь факторов, инактивация которых приводит к потере резистентности MRSA-штаммах, а при случае вызывает также дальнейшую сенсибилизацию уже чувствительных штаммов S. aureus, могут при определенных обстоятельствах быть использованы как мишени для новых антибиотиков. Разумеется, нужно учитывать, что в данном случае, также как у большинства раннее описанных факторов, за исключением /¿-mAB-оперона, достигаемый эффект, как правило, слишком незначителен, чтобы ожидать клиническую релевантность. Возможное исключение, тем не менее, могла бы составить ОЮ-инсерция, влияние которой на тес-резистентность сравнимо с влиянием /стАВ-оперона. Это предположение поддерживается и тем фактом, что определенная в этой работе частичная последовательность инактивированного гена не имеет, также как и УстАВ-оперон, никакой гомологии с известными протеинами. Исходя из вышесказанного можно при необходимости рассчитывать на получение возможных блокирующих субстанций с высоким уровнем специфичности.