Иммунохимическая характеристика структуры популяции специфических lgG и секретирующих их антителообразующих клеток в динамике инфекционного процесса: (Модель: экспериментальный грипп)

Актуальность работы, Несмотря на многочисленные исследования и значительный объем накопленного фактического материала проблема анализа гуморального звена противовирусного иммунитета остается актуальной, как в плане изучения механизмов действия факторов защиты С 523, так и в плане получения корректного прогноза заболевания С74].

Причины этого связаны с рядом аспектов, одним из которых является низкая информативность усредненных показателей, традиционно используемых в прикладной иммунологии при оценке состояния гуморального звена иммунитета С 56, 433 «Современные представления о свойствах популяции антител, определяемых клональной структурой С130, 913 и колебательным характером функционирования антителопродуцентов С147 3, предполагают необходимость детального исследования этой популяции, учитывающего гетерогенность антител по аффинитету.

Становление гуморального звена иммунитета при вирусных инфекциях включает как синтез различных субпопуляций антител, так и их элиминацию в ходе взаимодействия с антигенами репродуцирующегося возбудителя С1053″ При этом наличие значительны количеств вирусных антигенов в крови или в тканях, длительное присутствие которых характерно для вирусной патологии [14, 15 38, 41, 243, не только снижает уровень циркулирующих антител, но и оказывает существенное влияние на структуру их популяции С63, 453. Таким образом, характеристика лишь популяции свобод, но циркулирующих антител может не в полной мере отражать становление гуморального звена иммунного ответа и приводить к ошибочным заключениям о роли специфических иммуноглобулинов (Хд) в патогенезе вирусной инфекции.

В настоящее время становится ясным., что для получения адекватных оценок функционирования механизмов противовирусного иммунитета необходима выполнение комплексных исследований различных звеньев иммунного ответа в динамике их становления С 49, 56, 53Ц. Однако, возможность сопоставления получаемых показателей определяется заложенными в основу применяемых методов принципами СЮ]. Только в том случае, когда методы базируются на строго определенных физикохимических критериях может быть обеспечена универсальность сопоставления.

Все вышесказанное обусловливает актуальность совершенствования методических подходов анализа гуморального звена иммунного ответа при вирусной патологии.

Базой для получения адекватных оценок роли антител (АТ) и механизмов реализации их функций в патогенезе вирусных инфекций, могут стать методы исследования гетерогенной популяции специфических Ig, непосредственно продуцируемых В-клетками, основанные на таких определенных физико-химических понятиях, как аффинитет и концентрация.

Методические подходы анализа количества и аффинитета АТ, секретируемых антителообразующими клетками (АОК), были предложены в работах Ерне С132]. Их непосредственное применение для исследования гуморального звена иммунитета при вирусной инфекции сталкивается с рядом проблем, что и обусловило необходимость разработки новой технологии исследования, базирующейся на современных методах иммунохимии, математического моделирования и обработки результатов измерений. Созданию такой технологии и анализу с ее помощью гуморального звена иммунного ответа при экспериментальной гриппозной инфекции посвящена данная работа.

Цель и задачи работы. Основная цель работы заключалась в разработке методических приемов детального исследования гуморального звена имунного ответа при вирусной инфекции, базирующихся на иммунохимическом анализе гетерогенной популяции 1д0~секретирующих антителообразующих клеток (1д8~А0К) и продуцируемых ими антител.

Были определены следующие задачи?

1. Оптимизировать этапы иммунохимического анализа специфических АОК и секретируемых ими антивирусных 1д8.

2. Разработать алгоритмы оценки результатов эксперимента с реализацией их в виде соответствующего програмного обеспечения, позволяющие осуществлять автоматический сбор и анализ экспериментальных данных.

3. Разработать математическую модель процесса секреции АТ отдельными антителопродуцентами в условиях эксперимента, позволяющую оценить гетерогенность популяции 1д6~А0К, на основании анализа их продуктивности и аффинитета секретируемых АТ.

4. Используя разработанные принципы исследовать динамику Формирования гуморального звена иммунного ответа при раавитиии гриппозной инфекциии различной тяжести. При этом изучить изменение количества вирусспецифических ХдШ-АОК в пуле спленоцитов инфицированных мышей, структуру популяции этих АОК, их клональный спектр и продуктивность в сопоставлении с данными традиционого вирусологического и иммунологического анализа.

Научная новизна. Создана высокочувствительная и воспроизводимая автоматизированная технология исследования популяции специфических 1д6-А0К и секретируемых ими АТ.

Впервые осуществлена автоматизация этапа сбора и анализа результатов определения АОК, реализованая в виде пакета прик8 ладных программ на базе лазерного денситометра и персональной ЭВМ типа IBM-PC-AT.

Впервые предложена математическая модель процессов, лежащих в основе разработаного метода исследования антителопроду-центов, позволяющая оценить продуктивность индивидуальных IgG-АОК и аффинитет секретируемых ими AT.

С помощью созданного метода охарактеризована динамика формирования гуморального звена иммунного ответа при экспериментальном гриппе у мышейs.

— у интактных животных обнаружено предсуществование специфических IgG-секретирующих антителопродуцентов с низкой функциональной активностью;

— впервые описаны изменения в структуре популяции IgG-AOK, происходящие уже на ранних сроках инфекционного процесса (2−3 сутки) одновременно с появлением специфических XgG-содержащих иммунных комплексов и предшествующие появлению специфических IgG в циркуляции?

— впервые исследованы клональный спектр IgG-AOK и их продуктивность в динамике гриппозной инфекции. Показан колебательный характер изменения клональной структуры IgG-AOK и увеличение продуктивности AGK внутри клона;

— установлено, что в иммунном ответе принимает участие ограниченное количество клонов вирусспецифических IgG-AOK, а их распределение по аффинитету имеет дискретный спектр;

— описаны особенности формирования гуморального звена при гриппозной инфекции различной тяжести.

Получено экспериментальное подтверждение недостаточной информативности усредненных показателей количества специфических IgG-AOK и уровня циркулирующих в крови IgG-AT для оценки их роли в патогенезе вирусной инфекции. 9.

Теоретическое значение работы состоит в развитии представлений о механизмах формирования гуморального звена иммунного ответа и роли вирусспецифических 1д6 в патогенезе вирусной инфекции, а также обосновании соответствующей методологии исследования гуморальных эффекторов.

Практическая ценность работы. Работа носит в основном теоретический характер. Ее прикладной аспект связан с созданием способа комплексного исследования вирусспецифических антителопродуцентов, включающего оценку количества 1д0~А0К и их индивидуальной функциональной активности, выражаемой в количестве и качестве секретируемых АТ. Метод был использован при разработке эксперимениально-математической модели прогнозирования исхода вирусной инфекции и оценке перспективных препаратов антивирусного действия (совместно с сотрудниками Отдела вычислительной математики АН СССР, Одесского института эпидемиологии и вирусологии им. И. И. Мечникова и Проблемной лаборатории Оренбургского мединститута). На разработанный метод получено авторское свидетельство N 4 670 592/30−14(47 405).

Основные положения выносимые на защиту.

1. Разработан адаптированный к модельной гриппозной инфекции метод исследования вирусспецифических антителопродуцентов, включающий оценку количества 1д6~А0К и их индивидуальной функциональной активности, выражаемой в интенсивности секреции и качестве продуцируемых антител.

2. Предложена математическая модель процессов, лежащих в основе разработаного метода исследования антителопродуцентов, позволяющая оценить продуктивность 1д0~А0К и аффинитет секретируемых ими АТ.

3. Разработаны и реализованы в виде пакета прикладных программ алгоритмы оценки результатов эксперимента, обеспе&tradeчивающие автоматический сбор и анализ экспериментальных данных.

4. Применение разработанной методической базы позволило получить новую информацию о динамике становления гуморального звена иммунного ответа при экспериментальном гриппе разной тяжести! обнаружены изменения популяции 1д6~А0К в динамике гриппозной инфекции, не связаны®с увеличением их общего количества и зависимые от заражающей дозы вируса 5.

— выявлен колебательный характер изменений структуры популяции 1д6~А0К в динамике гриппозной инфекции и дискретность распределения вирусспецифических 1д6-АТ по аффинитету.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1.

Введение

.

Настоящий обзор данных литературы является попыткой обобщения некоторых современных представлений об особенностях формирования гуморального звена иммунного ответа при инфекционных, преимущественно вирусных, заболеваниях. Особое внимание будет уделено рассмотрению проблемы гетерогенности популяции АТ и антителообразующих клеток, как с позиции механизмов их индукции, так и в связи с недостаточностью знаний о путях реализации множественных функций АТ.

Во второй части обзора сделана попытка обосновать необходимость развития методов исследования гуморального звена иммунного ответа, базирующихся на четких и определенных физико-химических принципах, обеспечивающих возможность не только количественного определения содержания АТ и АОК, но и получения представлений о качественных характеристиках этих сложных популяций. Использование таких данных необходимо как для адекватного сопоставления результатов, полученных в разнородных экспериментах, так и для создания обобщенных моделей наблюдаемых процессов С493.

S.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

И з у ч е н и и ф о р м и р о в, а н и и г у м о р, а л ь н о г о з в е и, а и м м у и и о г о ответа традиционно отводится значительное место в исследо&tradeв, а н и я х ., с в я з, а и н ы х с, а и, а л и s о м и н Ф е к: ци о и н о г о в и р у с н о г о процесса. [70],.

0 д н, а к о, в н, а с т о я ще е в р е м я с т, а н о в и т с я о ч е в и д и о й н и з и: а я информативноеть ус: редненных показателей, традиционно и с по л ьзуемы х в прикладн ой и мм у, но логии п р и о ценк е с ос т о я ния гуморального звена иммунитета II56, 43], Современные представления о свойствах популяции антител, определяемых клональной структурой 11 130, 91], колебательным характером функционирования антителопродуцентов Г. 147] и разнообразием функций специфических T. g [ 19], предполагают необходимость детального исследования этой популяции, учитывающего гетерогенность антител по аффинитету„

С т, а н о в л е н и е г у м о р, а л ь н о г о и м м у н и т е т, а п р и в и р у с н ь i х инфекциях является сложным процессом, включающим как синтез различных субпопуляций антител, так и их элиминацию в ходе в займадейств ия с циркулирующим вирусом или антигенами репрО' дуцирующегося возбудителя [105], Наличие значительных количеств АГ в крови или в тканях, характерно®для вирусных инфекций [38, 24] оказывает существенное влияние на струю-т у р у п о п у л я ци и ци р к у л и р у ю щи х, А Т [', 6 3 ?, 4 5 ] «Э т о н е п о з в о л я е т одно з н, а ч, но инте рпре: тиров ат ь ре зу льт аты ис сле до в, а ни я у ро в ия АТ в крови и приводит к неопределенности при оценке роли АТ в патогенезе инфекции, если эти оценки основаны лишь на д, а н ных ан ализа с в об о дно цир кулир у ющих АТ «Д л я полу чения более корректных выводов о роли АТ в патогенезе первичной вирусной инфекции необходимо охарактеризовать весь пул АТ и, в том числе, АТ, непосредственно продуцируемые АОК».

Базой для адекватной оценки роли специфических АТ и механизмов реализации их функций в патогенезе Инфекций могут стать методы изучения структуры популяции специфических Ig, непосредственно продуцируемых АОК, основанные на определенных физико-химических понятиях, таких, как аффинитет и концентрация".

Разработке такой методической базы и оценке с ее помощью гуморального звена иммунного ответа при вирусной инфекции посвящена данная работа" Исследования были осуществлены в строго контролируемых по многим показателям условиях эксперимента на модели гриппозной инфекции у мышей" В основу разработки метода детального исследования гуморального звена иммунного ответа при вирусной инфекции были положены принципы иммунохимического определения АОК, Среди существующих методов, объединенных общим названием — иммуно-точечное определение АОК, можно выделить метод FIPA (Filter Immuno-Plaque Assay) [155″ I, обладающий рядом принципиальных достоинств s высокой чувствительностью, длительной сохранностью первичных материалов, применением в анализе безвредных стандартных реактивов" Этот метод, базируется на связывании АТ, секретируемых В-клетками, с фиксированным на НЦФ антигеном в непосредственной близости от клетки и последующем выявлении участков фиксации этих АТ в иммунофер-'-ментиом анализе" Для создания метода исследования гуморального звена противовирусного иммуинитета потребовалосьь используя эти принципы существенно их развить и дополнить, что было осуществлено за несколько этапов".

— отработка и оптимизаци я иммунохимичес кого определени я АТ класса 1д6 на НЦФавтоматизация этапа учета результатов 5 ~ оценка влияния условий культивирования суспензии с пленоцитов мышей на ре®у л ьтаты ис с ледов ания антителопро-дуцентов и оптимизация этих условий:!

— р, а з р, а б о т к, а м, а т е м, а т и ч е с к о й м о д е л и и с о о т в е «I» с т в у ю щ е г о програмного обеспечения, позволяющей оценить количество и аффинитет 1д6~~АТ, продуцируемых единичной АОК.

Для оптимизации иммунохимических этапов метода был выполнен ряд опытов, совокупность которых позволила выбрать приемлемые условия проведения эксперимента" Были изучены условия иммобилизации на НЦФ вируса гриппа А" Проведено сравнение блокирующих растворов, используемых для снижения неспецифического взаимодействия АТ и коньюгата с подложкой и иммобилизованными на ней гетерологичными АГ" Оптимизированы условия окраски НЦФ специфичным и обеспечивающим высокую чувствительность всего метода субстратом (п-фенилендиамин)".

В результате, создана экспериментальная база опреде. ления вирусспецифических 1д6~А0К и секретируемых ими АТ, иммунохимическая часть которой включает г, этап сорбции" ?5 качестве, А Г использовали очищенный в градиенте плотности сахарозы вирус гриппа А/РР!/8/34 в концентрации 0"6 мн/мл вирусного белка в физиологическом фосфатном буфере (ФФБ)" Сорбцию вируса проводили в течении .1 часа при комнатной 1: с, НЦФ отмывали от несвязавшегося белка.

199 средой, содержащей 107″ эмбриональной сыворотки., после чего фильтры помещали на дно лунок культурального планшета".

— этап культивирования спленоцитов&bdquoПоверх НЦФ с иммобилизованным АГ наносили суспензию спленоцитов инфицированных или интактных мышей, содержащую 5Х.103 клеток" Планшеты с фильтрами помещали в СОа-инкубатор (Ь°='3'7 «0°С, 'ЗУ, С0•-•,?.) на 3 часа» После чего НЦФ извлекали из планшетов, клетки смывали, интенсивно встряхивая фильтры в охлажденном растворе ФФБ, содержащем 10 мИ ЗДТА" Свободные участки связывания на НЦФ «забивали» инкубированием фильтров в ФФБ, содержащем обезжиренное молоко (18 1) «.

— этап связывания конъюгата" Фильтры переносили в раствор конъюгата (антитела против 1д0 мыши, меченные пероксидазой хрена) в рабочем разведении и инкубировали в течение ночи при 4°С&bdquoПосле серии промывок (3 раза в буфер©с молоком, 2 раза в ФФБ и 1 раз в дистиллированной воде) фильтры подсушивали".

— этап окрашивания&bdquoНЦФ помещали на 7 минут в раствор субстрата (1 мг/мл п-фенилендиамина в 0,2! М фосфат&tradeцитратном буфере рН 6,25), содержащий 0,05°/, ИжСЬ" Развитие окраски останавливали перенося НЦФ в дистиллированную воду" Подсчет окрашенных пятен, соответствующих индивидуальным 1д6-А0К, на сухих фильтрах выполняли визуально в проходящем свете".

С целью определения специфичности метода были выполнены эксперименты по определению вирусспецифичееких Iдв. АОК в пу ле с плено цит ов, пол ученны х от иифи циро в аниы х грип по м мышей, на ИЦФ, содержащих гомологичный «(вирус гриппа А), или гете-рологичные АГ (тени эритроцитов! барана или вирус гриппа В). Установлено, что количество 1дБ-А0К, определяемых в реакциях с гетерологичными АГ, сравнимо с количеством .ТдО-АОК в контроле (у неинфицированных мышей), и значительно меньше количества 1д8~А0К, обнаруживаемых на НЦФ с гомологичным АГ. Кроме количественных отличий опыта от контроля были выявлены качественные различия определяемых пятен, выражавшиеся в различии их интенсивности окраски и размера. Обнаруженная гетерогенность пятен, отражает функциональную гетерогенность самой популяции 1д (3-А0К, в которой постоянно представлены антителопродуценты из различных клонов и находящиеся на равных стадиях дифференцировки С123]».

Для объективной оценки характеристик пятен был разработан соответствующий способ учета, Получаемые после выполнения метода НЦФ, подвергали сканированию в двухмерном режиме на лазерном денситометре, с последующей пронрамной обработкой данных" Для каждого из фильтров получали таблицу определяемых оптически-плотных образований и строили распределение количества выявляемых пятен («следов» АОК) по величине их оптической плотности.

Полученные в виде гистограмм распределения характеризовались снижением количества выявляемых Iд (3-А0К по мере возрастания оптической плотности их «следов» при исследовании спленоцитов как инфицированных мышей, так и интактных животных. Естественно, общее количество выявляемых! СдБ-АОК, в случае анализа спленоцитов инфицированных мышей, было значительно больше.

Обнаружение специфических (реагирующих с вирусными АГ) IgB-AOK в контроле нельзя объяснить лишь артефактами методики, так как количество AOIC с низкой «активностью» (оптическая плотность пятен на НЦФ < 0−2) существенно увеличивается в результате развития иммунного ответа, По-в и димому, в ыс ока я чу в с твите л ьнос т ь предложенного метода позволяет регистрировать IgG-АОК с низкой продуктивностью и л и с е к р е т и р у ю щи е н и s к: о, а ф ф и н н ы е, А Т ш и р о к: о й с п е ци ф и ч и о с т и, способные связываться с АГ вируса гриппа. По данным Casal i Р, и N о t k i n s, А «L» II9 3 ] к о л и ч е с т в о т, а к и х к: л е т о к у и и т, а к т н ы х ж и в о т и ы х з и, а ч и т е л ь н о «.

Из анализа данных распределения IgG-AOK по интен. сивности окрашенных пятен следует также9 что, как абсолютное число определяемых в эксперименте АОК, так: и соотношение опыт/кантроль зав ис ят о т чувс тв ител ьнос ти используемого метода" Кроме этого, не совсем правомерным представляется вычитание количества АОК, определяемых в контроле, из их количества в опытной серии, так как: уровень АОК и в том и в другом случае может колебаться, но не всегда совпадать по Фазе или по частоте, что, в частности, характерно для некоторых иммунологи чес ких показателей при инфекции НИН С 89] .

Таким образом первые эксперименты, выполненные с р е, а л ь м о й к л е т о ч н о й п о п у л я ци е й, п р о д е м о н с т р и р о в, а л и н и s к у ю и н ф о р м ат й в н о с т ь и о т и о с и т е л ь и о с т ь т, а к о г о о б о б ще н н о г о показателя, как количество специфических АОК! «.

Оценка параметров каждого пятна позволила ввести объек. т и в н у ю х, а р, а к т е р и с т и к у ф у и к ци о н, а л ь н о й, а к т и в н о с т и и и д и в и д у, а л ь ной АОК, Уровень этой активности может быть выражен через величину оптической плотности пятна («следа» АОК) на НЦФ, проявляющегося в результате выполнения анализа., Если предпо. ложить, что интенсивность окраски каждого пятна пропорциональна как количеству так и аффинитету секретируемых клеткой АТ, то, следовательно, оптическая плотность пятна характеризует основную функцию АОК ~ продукцию АТ способных связываться с АГ с определенным сродством.

Описанный выше способ учета результатов позволил п р о, а и, а — л и з и р о в, а т ь в л и я и и е у с л о в и й иг. у л ь т и в и р о в, а и и я спленоцитов на результаты определния 1д6~А0К. Были исследованы влияние плотности клеточной суспензии, к о н цен т р, а ци и э м б р и о н, а л ь и о й с ы в о р о т к: и к р у п н о г о р о г, а т о г о с к: о т, а в среде культивирования и продолжительности культивирования, В ы я в л е н, а з н, а ч и т е л ь н, а я ч у в с т в и т е л ь н о с т ь к л е т о ч, но й по пу л я ци и к условиям культивирования" Влияние сказывалось как на общем количестве определяемых ХдСг-АОК, таи: и на их функциональной активности. Все это предполагает строгое соблюдение условий к у л ь т и в и р о в, а и и я в с о п о с т, а в л я е м ы х э и: с п е р и м е н т, а х «.

Таким образом, оптимизация иммунохимической части метода и привлечение соответствующей приборной базы для о це нки резул ь татов зкс п е римеит, а з, а ложили ос нов ы т ехно логии детального исследования гуморального звена иммунного ответа у инфицированных вирусом гриппа животных&bdquoВ результате, удалось объективизировать определение количества 1д6-А0К и и х ф у н к ци о н, а л ь н о й, а к т и в н о с т и п р и к р, а т к о с р о ч ном культивировании клеточной суспензии".

Детальная характеристика совокупности секретируемых АОК.

1д6~антител требует значительного увеличения объема * первичных данных, анализ которых не возможен без привлечения вычислительной техники, современных методов обработки результатов измерений и математического моделирования I" 9] «Для этого был разработан и применен автоматизированный способ учета результатов» Данные сканирования НЦФ передавали в режиме реального времени с денситометра на компьютер 1ВМ-" РО-АТ, Из полученной цифровой матрицы путей/! статистической медианной фильтрации с различными «окнами» и последующим поиском локальных максимумов, выделяли центры пятен (учитывали только сигналы, превышающие дисперсию «шума» минимум в 2.5 раза), регистрировали их количество, амплитуду и форму распределения оптической плотности по радиусу. Итогом этого этапа исследования было определение общего числа, пятен (количество 1дВ~А0К) в исследуемом препарате, расчет амплитуды оптической плотности каждого пятна (функциональная активность каждой АОК) и соответствующее их представление" Полученное распределение оптической плотности по радиусу использовали в математической моделе для оценки секретируемых АТ".

Таким образом, фактически удалось полностью автоматизм. ровать этап учета результатов, с представлением данных в удобной форме".

Для выявления характера соотношений между продуктив&tradeн о с т I" № и н д и в и д у, а л ь н ой, А О К, а ф ф и н и т е «I» о м с е к р е т и р у е м ы х I д 6 антител и параметрами окрашенных пятен, регистрируемых на НЦФ, была разработана математическая модель, описывающая процесс диффузии антител из точечного источника, которым является АОК" При этом учитывалось, что клетка синтезирует гомогенные АТ с постоянной скоростью — (О), находится на границе между жидкой фазой (среда культивирования) и пористым иммуносорбентом (НЦФ с иммобилизованным АГ), а АТ, диффундирующие в НЦФ, одновременно связываются с АГ" Считая, что скорость секреции АТ и их количество много меньше скорости реакции АГ-АТ и количества сорбированного АГ" можно предположить, что реакция между ними идет в равновесных условиях и соотношение свободных и связанных АТ определяется уравнением закона действующих масс % 8ь ® К 3-е, где 8ь, -концентрация связанных АТ, 3* концентрация свободных АТ, К — константа равновесия реакции АГ-АТ (аффинитет)" Учтя все перечисленные положения и представив их в математической форме можно аналитически решить полученное выражение относительно Зь и таким образом описать предполагаемое распределение АТ (Вь), связавшихся вокруг (декретирующей клетки с АГ, фиксированным на НЦФ, за время культивирования" Однако, в реальном эксперименте при денситометрировании анализируется распределение не самих АТ&bdquoа распределение по НЦФ окрашенного продукта ферментативной реакции" Поэтому реальный пик оптической плотности, вследствие диффузии продукта от места синтеза до места фиксации на НЦФ, значительно шире пика распределения АТ" При этом мы исходили из предположения, что коньюгат (анти-ХдСЗ-мыши, меченные пероксидазой хрена) равномерно связывается с: 1дВ, иммобилизованными на АГ, а размер пор нитроцеллюлозной матрицы много больше размера молекул продукта ферментативной реакции„

Учтя в математической модели описанные выше процессы, у далось промо дели р о в ат ь распре делени е пр о дукт, а ферментативной реакции с высокой степенью (957.) с, а о т в е т с т в у ю щ е е р е a л ь н о и з м е р я е м о м у и о д н о в р е м е н н о о це н и т ь продуктивность (Q), аффинитет (К) и коэффициент диффузии (D) с е к р е т и р у е м ы х о т д е л ь н о й к л е т к о й, А Т «.

Даль и е й ш, а я в е р и Ф и к, а ци я м, а т е м, а т и ч е с к о й м о д е л и ос у щес: тв л я л ас ь ib ходе экс периментов с инфициров анными ж и в о т н ы м и п у т е м о це н к и с о о т в е т с т в и я п о л у чае м ь i х р е з у л ь т, а т о в данным, известным из литературы.

Разработка математической модели и создание програмного обеспечения явились завершающим этапом на пути создания мето дичее кой базы комплекс ног о ж: с ледов ани я, а и т и т е л о п р о д у ц е н т о в, я в л я ю щ и х с я и с т о ч н и к, а м и ф о р м и р о в, а н и я гуморального звена иммунного ответа.

В полном объеме методическая база была реализована при описании экспериментального гриппа&bdquoкогда одновременно на у-:) яду с анализом уровня вирусной репродукции и формиров анием гуморального иммунного отв ета удалос ь проанализировать не только общее количество в и р у с с: п е ци ф и ч е с к и х I g G — А О К, н о и о х ара к т е р и з о в, а т ь и х распределение по функциональной активности, а также исследовать структуру популяции секретируемых АТ" Все результаты исследования АОК, по форме представления можно.

разделить на 3 уровня, первый — количество IgS. АОК, определяемых в опыте, за вычетом контроля, второйраспределение АОК по величине их функциональной активности, и третий — структура популяции АТ, секретируемых АОК, Полученные результаты были сопоставлены с данными в и р у с, а л о г и ч е с к и х и и м м у н о л о г и ч е с к и х и с: с л е д о в, а н и й, характеризующих конкретный вирусный процесс.

В качестве исследуемой экспериментальной модели была использована гриппозная инфекция у мышей., детально описанная в ряде работ [57, 58], Для контроля за течением вирусной инфекции оценивали показатели вирусной репродукции содержание вируса и вирусного АГ в легких, Уровень этих показателей достигал максимума в период от 3 до 5 суток, как в случае летальной, так и сублетальной форм инфекции, естественно, с некоторым превышением при более высокой заражающей дозе вируса".

Гуморальное звено иммунного ответа оценивали по уровни) в иру сс пецифи чес ких I g В и цирку лиру ивщих I g ?-c од ержащих специфических иммунных комплексов (ИК) в сыворотке. Накопление IgO-AT происходило сходным образом при обеих формах инфекции, начиная с. 6 суток, и их количество поддерживалось на высоком уровне на протяжении всего срока наблюдения (до 21 суток),.