Гликозаминогликан-связывающие варианты вируса клещевого энцефалита

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является переносимым клещами представителем рода Flavivirus, вызывающим тяжёлые заболевания человека, характеризующиеся поражением центральной нервной системы (ЦНС).

Гликозаминогликаны (ГАГ) — линейная полисахаридная молекула, которая экспрессируется на поверхности почти всех клеток млекопитающих, а также у организмов различных типов, таких как хордовые и членистоногие. Эти молекулы играют важную роль во взаимодействии клетки с внеклеточным матриксом, межклеточном сигналинге как рецепторы, и ко-рецепторы. Различные по структуре вириона и схеме репликации вирусы используют ГАГ как молекулы связывания с поверхностью клетки и/или молекулы, проникновения в клетку, однако в большинстве случаев эти молекулы не являются уникальными рецепторами.

Ранее на примере ВКЭ было показано, что флавивирусы используют два типа рецепторов на поверхности клеток-мишеней: малочисленный высокоаффинный и многочисленный низкоаффинный. Существует несколько типов молекул, претендующих на роль низкоаффинного рецептора: интегрины, высокоаффинный ламинин-связывающйй белок, гепарансульфат гликозаминогликаны (ГС-ГАГ) и другие.

Ранее для некоторых семейств вирусов, включая флавивирусы, были описаны варианты с повышенной аффинностью к ГАГ. Эти варианты объединяла высокая степень аттенуации для животных.

Описанные ранее лабораторные варианты флавивирусов, включая ВКЭ, с повышенной аффинностью к ГАГ, были получены при адаптации вируса к клеткам ВНК-21, SW-13, Neuro-2 или к клещам разных видов. Эти ГАГ-связывающие варианты обладали специфическими свойствами, основными из которых являлись мелкобляшечный фенотип в культуре клеток почки свиньи и низкая нейроинвазивность. Все варианты в процессе адаптации приобрели мутации, повышающие заряд поверхностного гликопротеина вириона Е. Влияние на структуру белка Е подобных мутаций, изменяющих взаимодействие вирионов с рецептором, не изучалось, также как и существование ГАГ-связывающих вариантов в природной-популяции флавивирусов, в том числе и в. популяции ВКЭ. .

Структура эктодомена молекулы белка оболочки Б ВКЭ была впервые получена Rey с соавторами (1995), затем был проведён-рентгеноструктурный анализ частичных или полных структур для других представителей рода Flavivirus. Изучение свойств молекулы белка не проводилось, в том? числе и моделированием молекулярной динамики in silico. Подобное изучение характеристик структуры белка может быть крайне полезно при создании, новых лекарственных соединений, так как позволит учесть дополнительные параметры для рационштьного дизайна препаратов:

Цель и задачи работы: Целью данной работы являлось изучение влияния аминокислотных замен, повышающих заряд молекулы поверхностного гликопротеина Е ВКЭ, на аффинность к клеточным ГАГ, структуру белка Е и биологические характеристики вируса.

Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1. Охарактеризовать свойства и аффинность к ГАГ набора штаммов ВКЭ, выделенных в разных частях России и стран Балтии.

2. С использованием нескольких штаммов ВКЭ с различной аффинностью к ГАГ определить, каждая ли мутация, повышающая заряд поверхностного гликопротеина Е, приводит к образованию варианта с ГАГ-связывающим, фенотипом.

3. На основе набора вариантов штамма ЭК-328, полученных при адаптации к клещам и переадаптации к клеткам млекопитающих, изучить влияние некоторых мутаций на структуру белка Е, аффинность к ГАГ и другие свойства вируса.

Научная новизна.

Впервые показано, что циркулирующие в природе варианты ВКЭ могут значительно различаться по аффинности связывания с ГАГ клетки.

Впервые выявлен и охарактеризован вариант с ГАГ-связывающим фенотипом среди природных изолятов ВКЭ, характеризующийся комплексом специфических свойств: повышенной сорбцией на гепарин-сефарозе, мелкой бляшкойв культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), низкой нейроинвазивностью при высокой нейровирулентности, отсутствием или снижением гемагглютинирующей активности (ГА) и. неспособностью формировать преципитат вирионов с антителами в ракетном иммуноэлектрофорезе (РИЭФ).

Впервые проведено моделирование пространственной^ структуры эктодомена поверхностного белка Е представителей всех трёх подтипов-ВКЭ.

Впервые in silico изучено поведение аминокислотных остатков в эктодомене гликопротеина Е и его связь с аминокислотной последовательностью белка. Показано, что одна аминокислотная мутация может привести к значительному изменению относительной подвижности аминокислотных остатков в эктодомене гликопротеина Е.

Впервые показано, что не любая аминокислотная замена, повышающая заряд поверхностного гликопротеина вириона, приводит к образованию вариантов с ГАГ-связывающим фенотипом.

Впервые показано, что данные, полученные при анализе молекулярной динамики (МД) эктодомена поверхностного белка вириона, позволяют предсказывать стабильность вирионов.

Впервые изучены молекулярные механизмы разной чувствительности ГА к детергентам и сниженной устойчивости вирионов ВКЭ к длительному температурному воздействию.

Научно-практическая ценность.

Получена принципиально новая информация о конформационной стабильности эктодомена поверхностного гликопротеина Е представителей рода Flavivirus.

Апробирован новый подход к изучению свойств вирионов на основе анализа результатов МД эктодомена белка оболочки.

Предложен новый подход к оценке относительной подвижности элементов вторичной структуры в молекулах белков in silico на основе численного описания подвижности аминокислотных остатков.

• Выявлено, что одиночные аминокислотные мутации могут приводить к значительному изменению относительной подвижности аминокислотных остатков эктодомена белка Е, что необходимо учитывать при разработке препаратов для лечения клещевого энцефалита на основе ингибиторов слияния и других соединений, действие которых основано на связывании с поверхностным гликопротеином вириона. Также было выявлено, что одиночные аминокислотные мутации могут приводить к резкому изменению свойств вириона, в том числе его устойчивости к внешним воздействиям, что важно при разработке вакцинных препаратов.

Определены нуклеотидные последовательности белков оболочки Е для ряда штаммов, изолированных в разных частях России и стран Балтии, и депонированы в, международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank, Ms GU121963, GU121964, GU121965, GU121966, GU125720, GU125721, GU125722, GU121967, GU125719).

Обзор литературы I. Краткая характеристика рода Flavivirus.

Семейство Flaviviridae состоит из трёх родов Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus. Многие представители рода Flavivirus вызывают тяжёлые заболевания человека: вирус клещевого энцефалита, вирус жёлтой лихорадки, вирус японского энцефалита, вирус Западного Нила, четыре серотипа вируса Денге и другие.

Выводы.

1. Циркулирующие в природе варианты, вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) значительно различаются по аффинности связывания с гликозаминогликанами (ГАГ) поверхности клетки. ГАГ-связывающий фенотип характеризуется комплексом специфических свойств: повышенной сорбцией на гепарин-сефарозе, мелкобляшечным фенотипом в культуре клеток почки свиньи, низкой нейроинвазивностью при высокой нейровирулентности, отсутствием или снижением гемагглютинирующей активности и неспособностью формировать преципитат вирионов с антителами в ракетном иммуноэлектрофорезе.

2. Не любая аминокислотная замена, повышающая заряд молекулы белка Е, приводит к повышению аффинности взаимодействия с ГАГ клетки и проявлению комплекса специфических свойств.

3. Одним из факторов, определяющих аффинность связывания вирионов вариантов ВКЭ с гепарансульфат ГАГ, является относительная подвижность аминокислотных остатков эктодомена белка Е.

4. Корреляционные карты, описывающие относительную подвижность аминокислотных остатков эктодоменов белков оболочки Е ВКЭ, могут значительно отличаться друг от друга. Варианты ВКЭ, значительно различающиеся по аминокислотной последовательности эктодомена белка Е (принадлежащие к различным подтипам), могут обладать сходными корреляционными картами, и варианты вируса, различающиеся только одной аминокислотной заменой в белке Е, могут значительно отличаться по подвижности его молекулы.

5. Конформационная подвижность эктодомена гликопротеина оболочки Е вносит существенный вклад в определение стабильности вирионов (устойчивость к длительному температурному воздействию и устойчивость гемагглютинирующей активности к детергентам).

Благодарности.

Я, искренне благодарна «д. б.н. Г. Г. Каргановой за научное руководствонеустанное внимание и поддержку.

Выражаю глубокую благодарность дирекции ИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН (академику РАМН С. Г. Дроздову и профессору М.И. Михайлову) за предоставленную возможность выполнения данной работы. Я выражаю искреннюю благодарность к.б.н. Медведкиной O.A. за неоценимую помощь на пути к официальной защите диссертации.

Благодарю сотрудников кафедры органической химии Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова Осолодкина Д. И. за непосредственное' участие в настоящей работе и к.х.н. Палюлина В. А за внимание, ей посвященное.

Также благодарю сотрудников ИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН: к.б.н. Романову Л. Ю., Шевцову A.C., Рогову Ю. В., к.б.н. Гмыль JI.B., к.м.н.

Дживанян Т.И.], Блинову P.C., Морозову Т. П. за непосредственную помощь и участие в данной работе, к.б.н. Гмыль А. П. за поддержку, ценные советы и плодотворные научные дискуссии, к.м.н. Ливанову Г. П. за предоставление необходимых для настоящей работы материалов.

Я благодарна официальным оппонентам д.б.н. Калининой Н. О. и д.б.н. Гамбарян A.C., а также рецензенту к.б.н. Воровичу М. Ф. за внимательное прочтение работы и ценные замечания.

Я благодарна всем соавторам моих работ, не упомянутых выше, за помощь в проведении исследований.

Я благодарю своих родителей, Козловского И. Ф. и Козловскую И. А., за помощь, внимание и любовь на каждой ступени моего пути к созданию этой работы.

Я благодарю своих друзей, особенно Селиванова A.B., за ненавящивую поддержку во время создания данной работы.