Активированные кислородные метаболиты в биологических системах

Введение

Активированные кислородные метаболиты в биологических системах. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных и окислительных процессов. Перекисное окисление липидов Активированные кислородные метаболиты. Общие сведения Классификация АКМ Биологическая роль АКМ Антиоксиданты Общие сведения Витамин С Каротиноиды Витамин Е Селен Глутатионпероксидаза Перекисное окисление липидов Материалы и методы Общие сведения Выделение микросом печени крысы Исследование индукции ПОЛ Определение концентрации белка по методу Бредфорда Результаты и обсуждение Выводы Список литературы

Кислород является самым распространённым химическим элементом биосферы, его соединения в состав всех живых организмов на планете. Наиболее широко представлена восстановленная форма кислорода, или вода (H₂O); для высших форм жизни необычайно важен молекулярный кислород (O₂), реакция восстановления которого до H₂O составляет основу биоэнергетики организма человека и животных.

Около 90% потребляемого человеком молекулярного кислорода вовлекается в реакции окислительного фосфорилирования, вместе с тем во всех живых организмах постоянно протекают реакции с образованием активированных кислородных метаболитов (АКМ): O^?₂, ¹O₂, H₂O₂, HO^?, OCl^?, RO₂ и др. Многие из этих соединений являются радикалами, то есть имеют неспаренный электрон, поэтому часто их называют свободными радикалами. Связанные радикалы, такие как компоненты цепи транспорта электронов в митохондриях, также широко представлены в клетках, однако их локализация в определённых структурах ограничивает «свободное» взаимодействие с другими молекулами. По оценке Гельмута Эстербауэра, человек за 70 лет жизни потребляет 17 000 кг кислорода; за это время в организме нарабатывается 800−1700 кг кислородных радикалов. АКМ, образующиеся в процессе нормальной жизнедеятельности животной клетки, индуцируют в ДНК около 10 000 повреждений за сутки. При этом генерация АКМ, очевидно, есть не эволюционная ошибка (неудача), а, напротив, — характерный физиологический процесс, результат революционного отбора.

Образование АКМ, известных как прооксиданты, наблюдается во многих метаболических процессах и является обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни. Функционирование и развитие клеток, и организма в целом, в кислородосодержащем окружении не могло бы быть возможным без существования защитных систем, основу которых составляет ферментативные и неферментативные антиоксиданты. Постоянное образование прооксидантов в живых организмах уравновешено их дезактивацией антиоксидантами, поэтому для поддержания гомеостаза необходима непрерывная регенерация антиоксидантной способности. Отсутствие или сбои этой непрерывности сопровождаются накоплением окислительных повреждений и приводят к возникновению окислительного стресса, который является составным элементом целого ряда патологических процессов и заболеваний, таких как воспаление, реперфузионное поражение тканей, бронхолёгочные заболевания, старение, канцерогенез и др. [5][6].

Важную роль в антиоксидантной системе играет селен. Хотя сам по себе селен и не является «прямым» антиоксидантом, он принимает активнейшее участие в процессе синтеза фермента глутатионпероксидазы — мощнейшего антиоксидантного вещества, предохраняющего клеточные мембраны от разрушительного воздействия свободных радикалов. Без достаточного содержания селена этот важнейший фермент просто не будет образовываться.

В качестве антиоксиданта и детоксикатора ядовитых веществ селен защищает организм от сердечных заболеваний, усиливает иммунитет, увеличивает продолжительность жизни. Действуя совместно с другими антиоксидантами — витаминами Е и С, селен помогает улучшить мыслительные способности, снижает депрессию, прогоняет усталость.

антиоксидант окислительный липид биологический

Активированные кислородные метаболиты в биологических системах. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных и окислительных процессов. Перекисное окисление липидов

Активированные кислородные метаболиты. Общие сведения

АКМ — высокореакционные, преимущественно радикальные, кислородные соединения, образующиеся в живых организмах в результате неполного восстановления молекулярного кислорода или изменении спина одного из его электронов, находящихся на внешних орбиталях.

Применительно к биологическим системам понятия «свободные радикалы» и «АКМ» не совпадают — неспаренный электрон может быть локализован на атомах углерода, серы, азота; так, для живых организмов важное значение имеют тиильные радикалы глутатиона (GS^?) или радикалы мочевой кислоты с локализацией электрона на атомах Sи N. С другой стороны, такие кислородсодержащие молекулы, как перекись водорода, синглетный кислород, гипогалогениты не являются радикалами, хотя и взаимодействуют с органическими молекулами через радикальные механизмы. Чтобы объединить данные соединения в одну группу с радикалами, вводят понятие «активные формы кислорода» или «активные метаболиты кислорода», которыми обозначают ферментативные продукты активации кислорода. По аналогии с активными формами кислорода иногда говорят об активных формах азота, обозначая так продукты преобразования NO-радикалов (NO^?, NO⁺, NO^?, NO₂, ONOOH), активных формах галогенов (HOCl, OCl^?, HOBr, HOI), активных формах липидов (L^?, LO^?, LO₂^?, LOOH). В биологическом плане наиболее удачно понятие «активированные кислородные метаболиты», под которым подразумевается широкий класс кислородных соединений радикальной и нерадикальной природы.

В живых организмах существуют два принципиально разных источника АКМ: радикальные окислительные реакции и металлопротеиновые ферментативные системы. В обоих случаях молекулярный кислород выступает акцептором электронов, а появление АКМ является результатом неполного восстановления молекулы O₂[7].

Классификация АКМ

Первоначально все радикалы, образующиеся в живом организме, было принято делить на свободные, которые легко мигрируют в водных или липидных средах, и связанные, структурно закреплённые и участвуюшие в цепях переноса электронов. Такое деление достаточно условно, в частности, непонятно, к свободным или связанным относятся в таком случаем убисемихинонные радикалы, которые достаточно легко перемещаются в липидных мембранах.

Введённые в последующем понятия «активные формы кислорода и азота», «активные формы хлора», «активные формы липидов» отражали желание исследователей строго определить и классифицировать весьма разнородный класс соединений, объединённых нами под общим названием активированных кислородных метаболитов (АКМ).Сегодня наиболее удачная классификация таких соединений предложена Ю. А. Владимировым[8], согласно которой все образующиеся в организме АКМ в зависимости от происхождения могут быть разделены на первичные, вторичные и третичные; среди причин появления чужеродных форм АКМ также можно выделить 3 основных фактора: радиация, оптические излучения и ксенобиотики (см. табл. 1).

Деление АКМ наприродные и чужеродные оправдано с позиций их биологической значимости. Действительно, основной функцией природных форм АКМ является регуляторная, затем защитная, в определённых ситуациях, как правило, патологических, они могут становиться токсичными и индуцировать развитие деструктивных процессов, однако такие ситуации являются исключением, а не правилом. Образующиеся при действии радиации или в процессе фотодинамической терапии чужеродные формы АКМ, также как радикалы, возникающие в процессе метаболизма ксенобиотиков, обладают выраженным цитотоксическим и деструктивным действием.

Таблица 1

Иногда в целях регуляторного воздействия применяются доноры NO^?; попытки усилить защитные функции организма посредством индукции образования АКМ сегодня носят достаточно экзотический характер.

Первичные формы АКМ или радикалов образуются с участием специализированных молекулярных механизмов, таких как мембранные НАДФН-оксидазы (восстанавливают O₂ в O₂^?), NO-синтазы (продуцируют NO^?) или фотосенсибилизированные процессы, являющиеся основными источниками ¹O₂. Как правило, эти продукты ферментативного восстановления O₂ или его активации, количество весьма ограничено: O₂^?, H₂O₂, ОH^?, NO^?, ¹O₂. Строение и заполнение молекулярных орбиталей O₂подчиняются квантовым законам, что существенно ограничивает количество образующихся продуктов. Первичные АКМ инициируют образование в реакциях свободнорадикального окисления большего числа вторичных радикалов липидов, белков, сахаров, нуклеиновых кислот, многие из которых более токсичны. Деление на первичные и вторичные АКМ или радикалы вполне оправдано, так как позволяет при патологических процессах выделить главные молекулярные механизмы генерации АКМ. Однако, как и в случае с многими другими понятиями свободнорадикальной биологии, дать строгие определения первичных, вторичных и третичных радикалов сложно, так же как сложно точно определить понятие антиоксиданта.

Биологическая роль АКМ

Общая особенность АКМ — высокая реакционная способность и малые значения времён жизни в биологических субстратах, что делает их эффективным инструментом локального действия. Так, действие OH-радикала (радиус диффузии 23 A) [10]ограничено размером средней ограниченной молекулы (например, величина молекулы пепсина — молекулярная масса 35 кДа — составляет 37? 74 A). Анион-радикал O₂^? и синглетный кислород обладают большим радиусом действия, сравнимым с размером клетки, однако уже на клеточном уровне их эффект строго локализован наличием высокоэффективного ферментативного антиоксиданта — супероксиддисмутаза (СОД), а также других антиоксидантов — таких, как витамин E, который инактивирует ¹O₂ посредством физического взаимодействия на расстоянии ~ 50 A. Сфера влияния радикалов NO^? распространяется уже на определённые клеточные структуры, такие как мышечные клетки сосудов, что вызывает их релаксацию, при этом оксид азота принципиально не отличается от гормональных мессенджеров и имеет свой «рецептор» — растворимую гуанилатциклазу. Наибольшим дальнодействием, проявляющимся на тканевом и организменном уровнях, обладают продукты радикальных реакций; так, процессы ПОЛ приводят к образованию альдегидов, эпоксидов, липидных перекисей, которые ингибируют синтез ДНК и деление клеток и в то же время индуцируют развитие опухоли. По-видимому, ПОЛ и его продукты, выступая в роли «первичного медиатора» стресса или «SOS-ответа», представляют один из наиболее ранних регуляторных механизмов, который в процессе эволюции трансформировался в ферментативную эйкозаноидную регуляцию. Окисленные фосфолипиды по свойствам сходны с фактором активации тромбоцитов и могут имитировать действие цикотина на клетки непосредственно через специфический для него рецептор.

Высокая реакционная способность АКМ делает их чрезвычайно токсичными для биологических систем на всех уровнях — от молекулярно-клеточного до организменного. В конце 40-х годов толчком для широкого изучения токсических эффектов АКМ послужили исследования действия радиации на живые организмы. В настоящее время можно утверждать, что АКМ занимают ведущее место в патогенезе радиационного поражения; деструкции тканей, вызванной развитием воспалительной реакции, и связанного с хроническим воспалением опухолеобразования; постишемических, реперфузионных и гипероксических повреждений; а также целого ряда бронхолёгочных, сердечнососудистых и других заболеваний. Вместе с тем механизм патофизиологического действия АКМ во многих случаях не ясен, так как утверждение о патофизиологической роли АКМ обычно строится на двух косвенных аргументах: а) интенсивность продукции АКМ коррелируют с развитием патологического процесса; б) ингибиторы АКМ обладают защитным действием.

Открытие явления дыхательного «взрыва» в фагоцитах послужило началом широкого изучения микробицидного действия АКМ, их роли в защите организма. При этом ярко выявилось, что генетически обусловленные нарушения механизмов генерации АКМ (больные с хронических гранулематозом или дефицитом миелопероксидазы) или их ингибирование лекарственным препаратами приводит к снижению неспецифического иммунитета и является причиной либо гибели организма от инфекций, либо развития хронических патологий.

В последние годы выявлен широкий спектр физиологических эффектов АКМ, к которым прежде всего относятся регуляция клеточной пролиферации и тонуса сосудов, индукция транскрипции определённых генов. Показано функционирование АКМ в качестве вторичных внутриклеточных мессенджеров. Так, АКМ непосредственно участвуют в активации онкогенов c-focи с-myc, а также гена c-jun, кодирующего главную форму фактора транскрипции AP-1, в ответ на ионизирующую радиацию. O₂^?и H₂O₂ активируют фактор транскрипции NF-кB, который вызывает экспрессию генов, кодирующих ряд цитокинов и вирусов, в том числе ВИЧ, а NO^?подавляет активацию NF-кB, индуцируя экспрессию ингибитора фактора транскрипции IкBби стабилизируя его. Стимуляция НАДФН-оксидазы нейтрофилов сопровождается активацией тирозинкиназ, при этом повышение накопления фосфотирозина обусловлено не только активацией АКМ фосфорилирования тирозина, но и ингибированием дефосфорилирования. В индукции синтеза белков теплового шока, повышающих резистентность клеток к высоким температурам, радиации, токсическому действию ионов тяжёлых металлов и лекарственных препаратов, основная роль отводится перекиси водорода.

Выделяемая из облучённых фоторецепторов H₂O₂ увеличивают длину и количество микроворсинок клеток пигментированного эпителия, что способствует более тесному контакту этих двух типов клеток и реализации антиоксидантных функций эпителия. NO^?и CO^? связываются с гемовой частью гуанилатцитклазы и обратимо изменяют синтез цГМФ, являясь важным компонентом внутрии внеклеточной коммуникации. NO^? участвует в посттранскрипционном контроле метаболизма железа.

Таким образом, образование АКМ в организме нельзя рассматривать, как существующий, но не обязательный элемент процесса жизнедеятельности.

Окислительные процессы с участием АКМ является неотъемлемым звеном существования высших форм живых организмов, негэнтропийное состояние которых поддерживается посредством снижения электронной упорядоченности молекулярного кислорода в результате его восстановления. Однако многие вопросы регуляторной функции АКМ, их взаимодействия с антиоксидантами, физиологической и патофизиологической роли сегодня всё ещё остаются спорными.

Антиоксиданты

Антиоксидант — это любое вещество, которое, присутствуя в низких по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, существенно задерживает или ингибирует его окисление.

По химической природе биоантиокислители представляю собой широкий класс соединений: ферменты (СОД, каталаза ГПО), фенолы и полифенолы (токоферолы, эвгенол, конидендрин, пирокатехин, производные галловой кислоты), флавоноиды (рутин, кверцетин), стероидные гормоны (лецитин, кефалин) и многие другие соединения. В зависимости от растворимости различают жирорастворимые (витамины E, A, K, стерины, убихинон) и водорастворимые (витамины С, B₆, PP, серотонин, SH-содержащие соединения) биоантиокислители [16], по молекулярной массе выделяют группу низкомолекулярных антиоксидантов (глутатион, аскорбат, в-каротин, б-токоферол, мочевая кислота) и высокомолекулярных, не способных проникать через биологические барьеры (ферритин, каталаза, пероксидазы и др.).

По принципу антиокислительного действия в биологических системах все антиоксиданты могут быть разделены на антиоксиданты косвенного (опосредованного) действия и антиоксиданты прямого (направленного) действия. Такое деление удобно при рассмотрении патологических процессов, сопровождающихся развитием окислительного стресса, в этом случае все соединения, повышающие синтез эндогенных антиоксидантов, нормализующие метаболические процессы и стабилизирующие клеточные структуры, могут быть отнесены к антиоксидантам косвенного действия. Естественно, что эффективность антиоксидантов косвенного действия проявляется только в живых системах. Соединения, непосредственного подавляющие окислительные процессы с участием АКМ invitroиinvivo можно рассматривать как антиоксиданты прямого действия. В зависимости от точки приложения действие антиоксиданта может осуществляться посредством одного или нескольких механизмов:

I: ингибирование радикальных форм АКМ, способных отрывать атом водорода с образованием органических радикалов;

II: изменение структурной организации, затрудняющее окисление;

III: локальное снижение концентрации и предотвращение его включения в окисление;

IV: взаимодействие с органическими радикалами и предотвращение развития ценных окислительных процессов;

V: связывание или окисление ионов металлов переменной валентности, индуцирующих разложение перекисей и образование радикалов;

VI: перевод перекисей в стабильные продукты окисления: спирты альдегиды, кетоны.

Соединения, реализующие свой антиоксидантный эффект посредством механизмов II, III, V, VI, иногда называются превентивными антиоксидантами, в то время как пути Iи IV характерны для ингибиторов АКМ, действие которых в достаточной степени специфично.

По мере развития наших знаний об окислительных процессах с участием АКМ изменяется и представление об антиоксидантных механизмах защиты. До недавнего времени рассматривалась преимущественно патогенная функция АКМ, реализующаяся посредством активации процессов ПОЛ в биомембранах; при этом считалось, что как в норме, так и при патологических процессах необходимо ингибировать наработку АКМ и снижать активность ПОЛ[16]. Исследования последних лет выявили участие АКМ в регуляции тонуса сосудов, клеточной пролиферации, синтеза простагландинов, в микробицидном действии фагоцитов, в регуляции метаболических процессов в качестве внутриклеточных мессенджеров. При этом поднимается вопрос о целесообразности в определённых ситуациях ингибирования наработки АКМ, что имеет важное практическое значение, так как с позиций существующих представлений сложно объяснить лечебный эффект введения перекиси водорода в низких концентрациях или аутотрансфузии УФ-облучённой крови. Применение антиоксидантных витаминов (Е, С) и в-каротина в целях профилактики заболеваний в последние годы также ставится под сомнение.

Необходимо отметить, что понятия «антиоксидант» и «антиоксидантная защита» имеют очень размытый характер; перефразируя Германа Мелвилла, подробная систематизация антиоксидантных соединений равносильна попытке классифицировать составляющие мирового хаоса. Так, антиоксидантами можно назвать все вещества, снижающие активность ферментативных реакций наработки АКМ (например, аллопуринол), а также многие противовоспалительные препараты, ингибирующие развитие метаболического «взрыва» в фагоцитирующих клетках. Иногда вводится понятие «вторичная антиоксидантная система», которым обозначают специализированные ферментативные механизмы устранения окислительных повреждений в клетках, такие протеиназы, фосфолипазы, экзои эндонуклеазы и др. Своевременное удаление повреждённых молекул повышает устойчивость клеток к токсическому действию АКМ, и поэтому с позиций биологической системы и биологической значимости радикальных окислительных процессов такие ферментативные системы могут рассматриваться как антиоксиданты[7].

Рассмотрим основные антиоксиданты и их механизм действия.

Витамин С

Аскорбиновая кислота (витамин С; г-лактон 2,3-дегидро-L-гулоновой кислоты; 2-оксо-L-треогексо-1,4-лактон-2,3-ендиол) была впервые выделена в 1928 г. Альбертом Сент-Дьёрдьи. Её биосинтез происходит главным образом из углеводов: из галактозы либо из глюкозы. Она очень нестабильна и легко разрушается при нагревании в щелочных условиях, а также под действием кислорода в присутствии ионов металлов переменной валентности, катализирующих её окисление с образованием неактивных продуктов.

Аскорбиновая кислота — наиболее важный антиоксидант плазмы человека, где её содержание в норме составляет 20−60 мкМ; после курса приёма витамина С его уровень возрастает до 100−200 мкМ.

В биологических средах аскорбиновая кислота обладает чрезвычайно широким спектром антиоксидантных свойств; в число обезвреживаемых ею АКМ входят HOCl (что при ревматоидном артрите особенно важно для синовальной жидкости, где мала концентрация эффективного плазменного ингибитора HOClальбумина[15]), радикалы O₂^??, HO₂^?, RO₂^? и HO^?, синглетный кислород и др.

В клетках АК может также восстанавливать тиильный (GS^?) и тиопероксильный (GSO₂^?) радикалы глутатиона. Помимо прямого антиоксидантного действия витамин С инициирует включение железа плазмы в состав тканевого ферритина, что приводит к снижению содержания свободных ионов железа.

В экспериментальных исследованиях было показано, что аскорбиновая кислота может восстанавливать б-токоферильный радикал, тем самым возвращая б-токоферолу антиоксидантные свойства.

В присутствии Fe³⁺или Сu⁺аскорбат становится мощным прооксидантом (также это зависит от концентрации субстрата и условий протекания окислительных реакций).В качестве стабилизатора аскорбиновый кислоты может выступать мочевая кислота, которая ингибирует радикалы аскорбата и предотвращает его окисление железом.

Каротиноиды

Из натуральных продуктов выделено и охарактеризовано более 600 различных каротиноидов, среди которых наиболее изученными и часто встречающимися являются ликопин, б-, в-, гкаротины. Каротиноиды относятся к группе жирорастворимых растительных пигментов.

Наличие обобщённой системы р-электронов в молекулах каротиноидов приводит к низким значениям электронно-возбуждённых состояний молекул и служит причиной, что данные соединения могут легко окисляться и восстанавливаться с образованием радикалов. Показано, что каротиноиды — эффективные антиоксиданты, действующие в отношении алкоксильных и перекисных радикалов, синглетного кислорода, NO-радикалов и пероксинитрита.

Полиеновые углеводороды, и прежде всего каротиноиды, являются наиболее эффективными природными тушителями синглетного кислорода: константы скоростей взаимодействия основных каротиноидов с ¹O₂ находятся в пределах 10⁹-10¹⁰ М^-1 с^-1. Константа скорости взаимодействия в-каротина с ¹O₂ составляет 14? 10⁹ М^-1 с^-1, при этом одна молекула в-каротина вызывает конверсию 200−1000 молекул ¹O₂, что можно объяснить физическим механизмом тушения посредством переноса энергии на триплетный уровень в-каротина, который находится на 22 ккал/моль ниже уровня синглетного кислорода:

¹O₂ + в-каротин > O₂ + ³(в-каротин).

Такое свойство в-каротина делает его эффективным антиоксидантом в различных фотоиндуцированных процессах, сопровождающихся образованием ¹O₂, вместе с тем эффективность каротинов незначительна при окислении, вызванном H₂O₂и ионами металлов переменной валентности. Анализ ингибирования ¹O₂ разными по строению соединениями каротиноидной природы показал, что эффективность ингибирования возрастает с увеличением количества сопряжённых двойных С-С связей, наличие эпоксидной группы в наибольшей степени повышало эффективность по сравнению с карбонильными или гидроксильными заместителями.

в-каротин может участвовать в регенерации токоферильного радикала с образованием катион-радикала в-каротина, как это следует из реакции:

б-ТфО^? + H⁺ + в-каротин > б-ТфОН + в-каротин^?+.

Учитывая, что в-каротин представляет собой полиненасыщенное соединение, он сам может легко окисляться по радикальному механизму и выступать в качестве прооксиданта — индуктора свободнорадикальных реакций, особенно при увеличении его концентрации или pO₂в клетках. Антиоксидантные свойства в-каротина сильно зависят от содержания кислорода: при низких pO₂ (меньше 150 мм рт. ст.) он проявляет высокую антирадикальную активность, в то время как при высоких парцеальных давлениях (? 760 мм. рт. ст.) кислорода становится прооксидантом.

Витамин Е

Витамин Е (б-токоферол) как жирорастворимый фактор, необходимый для размножения крыс и содержащийся в высоких концентрациях в масле из проростков пшеницы и семян салата, был открыт в 1922 г. американскими учёными Гербертом М. Эвансом и Кэтрин С. Бишоп.

Соединения, родственные витамину Е (витамеры), представляю собой группу производных хроман-6-ола (6-гидроксихромана) — токоферолов, отличающихся степенью метилирования и местоположением метильных групп в хромановом ядре.

Биологическое действие витамина Е преимущественно связывается с его антиоксидантными свойствами, которые в большей или меньшей степени проявляются на всех уровнях организации — от субклеточных частиц в мембранных образований до организма в целом. Впервые антиоксидантное действие б-токоферолов было показано в 1954;м году Алом Л. Тэппелом. На сегодняшний день классическая теория антиоксидантного действия токоферолов, построенная на большом количестве экспериментальных данных по окислению жирных кислот в присутствии витамина Е, предполагает передачу атома водорода с молекулы токоферола (Тф-ОН) на пероксильный радикал (ROO^?) с образованием гидроперекиси:

Тф-OH + ROO^? > Тф-O^? + ROOH.

Константы скоростей реакций б-токоферола и его витамеров с пероксильными радикалами существенно зависят от растворителя и находятся в пределах от 10⁴ до 5? 10⁸ М^-1 с^-1. Достаточно эффективно б-токоферол взаимодействует с перекисными радикалами основных жирных кислот, входящих в состав клеточных мембран, константы скоростей этих реакций составили около 2,35? 10⁶ М^-1 с^-1[23]. В модельных системах б-токоферол эффективно взаимодействует с супероксидным анион-радикалом: константа скорости реакции O₂^?с б-токоферолом — 4,9? 10³ М^-1 с^-1, с его водорастворимым аналогом тролоксом — 1,7? 10⁴ М^-1 с^-1 при 25 °C и pH 7,8. Помимо реакции с переносом атома водорода

б-Тф-OH + O₂^? > б-Тф-O^? + HO₂^?

возможно также восстановление токофероксильного радикала при взаимодействии с O₂^?:

б-Тф-O^? + O₂^? > б-Тф-O^? + O₂

б-Тф-O^? + H⁺ > б-Тф-OH

В микросомах витамин Е одинаково эффективно ингибирует образование перекисей как в реакциях НАДФН-зависимого ПОЛ, так и при аскорбат-зависимом окислении, при этом сохраняется целостность мембранных липидов и активность ферментативных систем гидроксилирования.

Селен

Элементарный селен — это гомоцепной неорганический полимер с винтообразными макромолекулами, уложенными параллельно. В цепях атомы связаны ковалентно, а молекулы-цепи объединены молекулярными силами и частично — металлической связью.

Селен и его соединения используются в различных областях деятельности, в том числе в медицине и в производстве БАД. В частности, селен признан одним из важнейших антиоксидантов; этот элемент способствует детоксикации производных кислорода в организме (свободных радикалов) и играет немаловажную роль в борьбе с раком.

Важнейшей ролью селена является его вхождение в состав глутатионпероксидазы — фермента предохраняющего клетки от токсического действия перекисных радикалов.

Селен не может синтезироваться, а должен поступать с пищей извне. Следовательно, нет селена — нет глутатионпероксидазы. Имеется связь между селеном и витамином Е — они влияют на разные этапы образования органических перекисей: токоферолы подавляют (предупреждают) перекисное окисление полиненасыщенных жирных кислот, а содержащая селен глутатионпероксидаза разрушает уже образовавшиеся перекиси липидов, перекись водорода. Глутатионпероксидаза, не содержащая селен, — глутатион-S-трансфераза — разрушает только перекись водорода (как и каталаза). При достаточном поступлении в организм витамина Е проявления дефицита селена значительно нивелируются. Наибольшее количество селена содержится в белках с высоким содержанием цистина: образуются трисульфиды, которые подобно сульфгидрильным группам мембранных белков, регулируют стабильность и проницаемость мембран. При дефиците селена и снижении активности глутатионпероксидазы повышается гемолиз эритроцитов вследствие действия перекиси водорода и липоперекисей. На активность глутатионпероксидазы влияет уровень содержания витаминов С и А, которые способствуют усвоению селена, его транспорту и утилизации. Витамин Е предупреждает окисление селена, способствует его сохранению. Добавка селена при Е-дефицитном рационе тормозит накопление липоперекисей, ликвидирует или предупреждает симптомы Е-витаминной недостаточности. Восстановленныйглутатион и глутатионпероксидаза превращают липоперекиси в менее токсичные оксикислоты и этим предупреждают повреждение биоструктур. Пополнение фонда глутатиона происходит за счет аминокислот, которые содержат серу.

Глутатионпероксидаза

Для инактивации перекиси водорода в клетках высшых животных существует одно важное семейство ферментов — глутатионпероксидаз (систематическое название «глутатион: перекись-водорода-оксидоредуктаза»), существование которого показано Гордоном Милзом в 1957 г. В 1973 г. Джон. Т. Ротрак с соавт. установили, что в состав ГПО входит селен, и каждая молекула фермента содержала 4 атома Se.

Помимо это клеточной изоформы, получившей при дальнейшей классификации порядковый номер 1 (ГПО1), глутатионпероксидаза представлена селеновыми изоферментами — «желудочно-кишечным» (ГПО2, выделен из цитозоля клеток печени и кишечника), внеклеточным (ГПО3, выявляется в плазме и молоке), ГПО гидроперекисей фосфолипидов (ГПО4) и не содержащими Seизозимами-«секреторным» (ГПО5, обнаруживаемая в придатках яичек) и ГПО7, а также экзотический ГПО6, в состав которой селен либо входит (человек, свинья), либо не входит (мышь, крыса). Все ГПО в большей или меньшей степени катализируют реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов, включая гидропероксиды полиненасыщенных жирных кислот, в стабильные соединения — оксикислоты:

2GSH + ROOH > GSSG + ROH + H₂O

В результате взаимодействия с гидропероксидом ROOH селеноцистеиновый остаток фермента переходит из селенола в селененовую кислоту, с которой затем связывается GSHс образованием селененилсульфида:

ГПО-SeH + ROOH>ROH + ГПО-SeOH

ГПО-SeOH + GSH > H₂O + ГПО-Se-SG

Прореагировав со второй молекулой глутатиона, ГПО возвращается в исходное состояние:

ГПО-Se-SG + GSH > ГПО-SeH + GSSG

ГПО способны также утилизировать H₂O₂:

2GSH + H₂O₂>GSSG + 2H₂O

Кроме того, недавно обнаружено, что селеносодержащие ГПО проявляют пероксинитритредуктазную активность, восстанавливая ONOO^? до нитрит-аниона NO₂^?и тем самым предотвращая опасные реакции окисления и нитрования, в которые активно вступает пероксинитрит. Стехиометрия пероксинитритредуктазной реакции аналогична классической глутатионпероксидазной реакции с участием гидропероксидов: взаимодействуя с ONOO^?, фермент окисляется до селеновой кислоты и затем восстанавливается до исходного состояния двумя молекулами глутатиона; скорость реакции составляет 8? 10⁶M^-1c^-1[25].

Также селеновые ГПО играют важную роль в регуляции биосинтеза эйкозаноидов, контролируя содержание органических перекисей и поддерживая так называемый «перекисный тонус». Так, циклооксигеназа, переводящаяарахидоновую кислоту в циклоэндогидроперекисьPGH₂, активируется гидроперекисью, высокое содержание которой приводит к самоинактивации фермента. Обычная физиологическая концентрация гидроперекисей в клетках млекопитающих составляет около 10^-10 М, и её повышение до 10^-6 М вызывает активацию циклооксигеназы. Предпологается, что липоксигеназа, отвечающая за синтез лейкотриенов, простациклиновые и тромбоксановыесинтетазы, также являются объектами перекисной регуляции. С этой точки зрения становится ясно, насколько важна функция ГПО в патогенезе воспалительных процессов.

Перекисное окисление липидов

На сегодняшний день все физико-химические аспекты развития процессов свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ) биологических мембран изучены достаточно хорошо. ПОЛ — вырожденно-разветвленный цепной процесс, условно разделенный на стадии: зарождение цепей, развитие цепных реакций и их разветвление, обрыв цепей. Регуляция процесса возможна на всех его стадиях — при инициировании это достигается применением ловушек свободных радикалов (фенольные антиоксиданты, токоферолы, и пр.); при разветвлении — устранением высокоактивных и часто токсичных промежуточных продуктов с помощью как низкомолекулярных антиоксидантных компонентов (например, глутатион, аскорбиновая кислота, ионы металлов переменной валентности в определенных концентрациях или их связывающие соединения и пр.), так и различные антиоксидантные ферменты (СОД, глутатионпероксидаза, каталаза и пр.). Наконец, обрыв цепи возможен с помощью дисмутации радикалов или их замены на менее реакционноспособные радикалы ингибиторов. В настоящее время описано множество природных антиоксидантов с известными свойствами, как правило, являющихся ловушками свободных радикалов.

Учитывая важность ПОЛ как в возникновении и развитии различных патологических состояний, так и в регуляции нормальных процессов жизнедеятельности организма на всех его уровнях, не утрачен интерес к разработке новых препаратов, способных тем или иным способом оказывать направленное действие на протекание ПОЛ в клетке. К новым препаратам, активным в отношении ПОЛ, прежде всего, обычно предъявляется требование ингибировать развитие реакций этого процесса в качестве ловушек свободных радикалов кислорода. Однако, в связи с многовекторностью действия различных антиоксидантных систем, можно определить ряд потенциально полезных мембранопротекторных свойств даже для нецеленаправленно получаемых новых веществ. К ним относится, во-первых, гидрофобность молекулы вещества, то есть способность его легко проникать сквозь мембрану, что позволит соединению, как минимум, проникнуть в липидный бислой, а при определенных свойствах нового вещества и стабилизировать его (так называемый структурный антиоксидант). Во-вторых, наличие фенольных структур в его составе может придать соединению свойства фенольного антиоксиданта, который обладает прямой антирадикальной активностью. В-третьих, при определенных условиях гетероциклические соединения с различными функциональными заместителями могут служить переносчиками электронов, что особенно важно при функционировании дыхательных цепей внутриклеточных мембран (митохондриальной, микросомальной и т. д.) как для регуляции, так и для нормализации их работы при утрате нормальной концентрации естественных акцепторов свободных электронов. И наконец, синтетические органические вещества, имеющие в своем составе эссенциальные микроэлементы, вероятно, при определенных условиях могут выступать в качестве транспортных форм для этих элементов, прежде всегодля Se, необходимого для функционирования одного из ключевых антиоксидатных ферментовглутатионпероксидазы, особенно с учетом их гидрофобных свойств и низких эффективных концентраций. Однако, все эти предположения, безусловно, требуют экспериментального подтверждения.

Материалы и методы

Общие сведения

В наших исследованиях были изучены антиоксидантные свойства 18 новых гетероциклических соединений (4 из них — селеносодержащие), полученных в лаборатории органического синтеза Луганского национального педагогического университета имени Тараса Шевченко. Сначала были определены наиболее перспективные с точки зрения антиоксидантной активности соединения и установлены величины их оптимальной концентрации для простой модельной системы с лецитином яичного желтка, который служил элементарным субстратом процессов ПОЛ (этот эксперимент не входил в данную работу). Далее представлялось целесообразным изучить поведение этих веществ в опытах invitro, включающих более сложный объект — природные биологические мембраны.

В качестве подобного объекта мы использовали микросомы печени крыс, выделенные с помощью дифференциального центрифугирования мембраны эндоплазматического ретикулума, поскольку эта структура богата субстратами ПОЛ — полиненасыщенными жирными кислотами; в её составе функционируют цепи переноса электронов, что создает условия для образования радикальных форм кислорода; многие ферменты микросом относятся к металлопротеинам, т. е. связаны с металлами переменной валентности, что также играет роль в активации ПОЛ. Использование микросом позволяет в определенной мере стандартизовать условия проведения опыта.

Постановка эксперимента заключалась в искусственном индуцировании перекисного окисления липидов мембран микросом с помощью аскорбиновой кислоты и ионов железа (сольМора). Добавление этих компонентов в реакционную среду способствовало образованию активированных кислородных метаболитов (гидроксильных радикалов, пероксидных радикалов жирных кислот и т. д.). После инкубации в течение 30 минут в пробах спектрофотометрически определялось количество вторичного продукта ПОЛ — малонового диальдегида. По уровню его накопления судили об антиоксидантной активности добавляемых в реакционную среду исследуемых веществ. Для сравнения использовали ионол. Контролем служили образцы без активных веществ, но с добавлением растворителя (диметилсульфоксид, или ДМСО), который сам обладает некоторым антиоксидантным эффектом.

Выделение микросом печени крысы

Для выделения микросом мы декапитировали крысу, быстро вырезали печень и положили ее на 3 мин. на сахарозный лед для охлаждения. Затем осушили печень фильтровальной бумагой, взвесили 3−4 г и продавили через пресс. Далее её гомогенизировалии поместили в среду выделения (фосфатный буфер, сахароза и ЭДТА).

Полученный раствор центрифугировали 15 мин. при 2 тыс. об./мин. В осадок выпали обрывки клеток, ядра (ядерная фракция, которую необходимо удалить).

Далее надосадочную жидкость повторно центрифугируют 10 мин. при 5800 об./мин. В осадок выпадают митохондрии. Окончательно полученный супернатант и является микросомами печени крыс.

Исследование индукции ПОЛ

Для исследования индукции ПОЛ готовили 20% гомогенаты печени крыс в 100 мМ трис-HClбуфере, pH 7,4 и фильтровали его через 3 слоя нейлона. Интенсивность аскорбат-зависимого ПОЛ исследовалисразу после их приготовления, определяя накопление МДА в этот момент времени и через 30 минут инкубации гомогенатов при 37 °C постоянном помешивании в среде. Среда инкубации дополнительно содержала 0,5 мМ аскорбат и 12 мкМ моль Мора. Гомогенат вносили по 0,1 мл на 2,0 мл среды инкубации, при этом концентрация белка была около 0,5 — 1 мг в 1 мл. В среду барботировали воздух. Пробы для определения количества образовавшегося МДА брали после осаждения белка ТХУ (трихлоруксусной кислотой). При этом записывали спектр поглощения окрашенного продукта на спектрофотометре, определяя Е 532−580. Количество МДА рассчитывали, принимая коэффициент экстинкцииравным 1,56? 10^-5 М^-1 см^-1.

Определение концентрации белка по методу Бредфорда

Метод Бредфорда — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Метод основан на реакции красителя кумасси (coomassie) с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм. Таким образом, увеличение адсорбции раствора при длине волны, равной 595 нм, пропорционально количеству белка в растворе.

В спектрофотометрическую кювету с длиной оптического пути 1 см мы вносили 0,1 мл раствора белка в 0,1 н NaOH, добавляли 2 мл раствора кумасси, перемешивали при комнатной температуре 2−3 минуты и быстро измеряли оптическую плотность смеси при 595 нм, используя в качестве контроля кювету, содержащую 0,1 мл 0,1 н NaOH и 2 мл красителя.

Результаты и обсуждение

Как видно из приведенных данных, преимущественное большинство соединений, показавших в модельной системе антиоксидантный эффект, обнаруживало подобную активность и в более сложной системе. Однако были и исключения. В общем, подобное поведение антиоксидантов не является неожиданным. Известно, что усложнение системы, в которой проводятся испытания антиоксидантных свойств, приводит иногда к снижению эффективности препарата.

Именно этим фактом мы руководствовались, применяя в опыте концентрации веществ несколько более высокие, чем полученные для них величины ранее. Более того, в исключительных случаях может изменяться сама направленность эффекта — с антиоксидантной до прооксидантной. Это связано с синергическим эффектом при взаимодействии нескольких слабых факторов в живом объекте, приводящим к их резкому усилению.

Например, в клетке в определенных условиях может значительно возрастать энергия слабых радикальных соединений, их превращение в активаторов ПОЛ, тогда как в норме сами по себе они являются ингибиторами ПОЛ именно из-за своих радикальных свойств и не представляют опасности из-за низкой энергетичности. Это показано, в частности, в опытах с применением витамина Е. Разумеется, в каждом подобном случае причины изменения эффектов одного и того же соединения в разных условиях опыта могут быть совершенно различны, но все они, безусловно, связаны с взаимодействием того или иного соединения с какими-то структурами в изучаемой системе.

Как и в предыдущем исследовании, соединения I (DVD-2521), II (KDA-150), III (KDA-132), IV (BO-20),, V (DVD-8843), VI (DVD-2808), VII (DVD-26), VIII (NAA-85) проявили антиоксидантную активность, причем, в данном случае — в присутствии микросом. Это говорит о том, что, как минимум, эти вещества могут быть ловушками свободнорадикальных форм кислорода. Следовательно, их можно отнести к истинным антиоксидантам. Объяснить это можно различно.

Ожидаемо проявили сильные антиоксидантные свойства селеносодержащие соединения (I, V, VI). Вызвано это тем, что селен играют одну из самых важных ролей в антиоксидантной системе человека, взаимодействует с витаминаи, А и Е, принимает непосредственное участие в синтезе глутатионпероксидазы — сильнейшого антиоксиданта (как уже описывалось выше). И в следствие этого возникает такой сильный антирадикальный эффект.

Остальные 5 веществ, вероятно, смогли проявить антиоксидантную активность благодаря большому количеству сопряжённых двойных связей, которые выполняют роль свободнорадикальных ловушек. Также можно предположить, что в отличии от других соединений, которые будут разобраны ниже, молекулы данных являются более компактными (имеют меньшие размеры).

Остальные вещества не обнаружили антиоксидантного эффекта на микросомах, что, вероятно, можно объяснить следующим образом.

В нашем случае вещество XIII (Л-8) проявило при инкубировании с микросомами отчетливый прооксидантный эффект, т. е. активировало ПОЛ (более чем на 40%), тогда как в опытах с лецитином это вещество ингибировало липопереокисление, по-видимому, за счет улавливания и инактивации свободнорадикальных форм кислорода. Принимая во внимание структуру данного соединения, можно сделать вывод, что Л-8 действительно может связывать свободнорадикальные формы кислорода. В растворе лецитина это вызывает их инактивацию, поэтому процесс ПОЛ ингибируется, причем с примерно одинаковой эффективностью при разных концентрациях вещества, т. е. лимитирующим фактором, вероятно, является концентрация радикалов в среде. Однако при наличии мембранного липидного бислоя гидрофобная и довольно громоздкая молекула Л-8 проникает вглубь мембраны, задерживаясь там вместе со связанными кислородными радикалами. При встраивании молекулы Л-8 структура мембраны становится более рыхлая, радикалы кислорода получают свободный доступ к ненасыщенным жирным кислотам мембранных фосфолипидов, т. е. к субстратам ПОЛ. Проще говоря, мы считаем, что Л-8 может не только связывать, но и транспортировать радикальные формы кислорода в липидный бислой, встраиваясь в него и механически дестабилизируя его. Однако, для доказательства этого предположения целесообразно было бы сравнить влияние Л-8 на ПОЛ в лецитиновых липосомах. В подобной постановке лецитин находился бы не просто в растворе, а в составе липидного бислоя, состоящего исключительно из молекул лецитина.

Аналогичные выводы можно сделать, анализируя поведения соединения XII (DVD-0749). Следует отметить лишь, что его молекула по величине почти в 2 раза меньше Л-8, но также не является компактной молекулой. Вместе с тем, очень похожее визуально на DVD-0749 соединение XI (DVD-4702) проявляет умеренно антиоксидантные свойства в обоих случаях — и в простой безмембранной системе с субстратом ПОЛ лецитином, и при наличии этого же компонента (наряду с другими) в составе мембран микросом. Очевидно, что структурные отличия являются причиной разного поведения этих соединений, однако на данном этапе исследований не представляется возможным объяснить, каким образом.

Соединения XV (DVD-3779) и XIV (ВО-35) также, как и три вышеописанных, являются ловушками свободнорадикальных форм кислорода и, вероятно, могут переносить их в липидный мембранный бислой с разной степенью эффективности и в зависимости от типа этого бислоя.

Отдельно следует сказать о соединениях, которые были растворимы в воде — VIII (NAA-23)и XVIII (NAA-177). Они показали слабую антиоксидантную активность. Причем в случае с NAA-177 она не зависела от концентрации вещества в растворе с лецитином. В системе с микросомами препараты не функционировали как антиоксиданты. Вероятно, это связано с непроницаемостью для них липидного мембранного бислоя за счет их заряженности. Возможно, эти соединения могут проявить себя в другом биологическом качестве, например, они вполне могут действовать как нуклеофилы, участвуя в разобщении процессов дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях.

Таблица 2

Гистограмма всех показателей ингибирования в процентном соотношении относительно контроля

Выводы

1. Мы проверили 18 новых гетероциклических и селенсодержащих веществ на их возможные антиоксидантные свойства в перекисном окислении липидов. Часть соединений дали ингибирующий эффект, другие же никак не подействовали или даже проявили прооксидантные свойства.

2. Проведя этот эксперимент, мы выяснили, что очень актуальным и целесообразнымв данный момент является синтезирование новых препаратов, способных проявлять антиоксидантные свойства, а именно — ингибировать реакции процессов перекисного окисления липидов за счёт ловушек свободных радикалов кислорода. Причиной актуальности является огромная роль ПОЛ в регуляторных процессах всего организма, а также развитии различных патологических состояний.

3. Особое внимание стоит уделить селенсодержащим соединениям, так как:

а) Большинство из них дали сильный ингибирующий эффект;

б) Селен играет одну из самых главных ролей в антирадикальной системе человека за счёт содержания в главном антиоксиданте — глутатионпероксидазе, которая без поступления этого элементаизвне не может синтезироваться.

1. Иванов К. П. Основы энергетики организма: Теоретические и практические аспекты. Том 2. Биологическое окисление и его обеспечение кислородом. — СПб.: Наука, 1993. — c. 272.

2. EsterbauerH. Cytotoxicityandgenotoxicityoflipid-oxidation // Am. J. Clin. Nutr.- 1993.-Vol. 57, Suppl.- p. 779.

3. Dawson T.M., Bredt D.S., Fotuhi M. et. al. Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identicial in brain and peripheral tissues // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991. Vol. 88. p. 779.

4. Barja G. Oxygen radicals, a failure or a success of evolution? // Free Radic. Res. Commun.- 1993. Vol. 18. p. 63.

5. Зенков Н. К., Ланкин В. З., Меньщикова Е. Б. Окислительный стресс. Биохимическийипатофизиологическийаспекты.- M.: Наука/Интерпериодика, 2001. c. 340.

6. Sies H. Oxidative stress. — From basic research to clinical application// Am. J. Med.- 1991. Vol. 91, Suppl. 3C.- p.31.

7. МеньщиковаЕ. Б., ЛанкинВ. З., ЗенковН. К., БондарьИ. А., КруговыхН. Ф., ТруфакинВ. А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. — М., 2006. — стр. 12−13, 21−22, 141−143, 193−196, 228−231, 383, 389−390