Изучение фрактальных свойств поверхности белков

В современной физике конденсированного состояния большой интерес проявляется к изучению так называемых надатомных структур (наноструктур) — систем с характерными размерами 1−100 нм. Среди них особое место занимают биологические макромолекулы, в частности белки. Белки представляют собой сложные естественные полимерные образования, которые являются компонентом живой клетки и выполняют различные функции (см., например, монографию [1]). Так, белки отвечают за транспортировку и хранение веществ в клетке, служат катализаторами химических реакций, выполняют регуляторные, рецепторные и защитные функции, являются строительным материалом клеток и др. Белки воспроизводятся согласно генетическому коду, хранящемуся в клетках и, таким образом, являются неотъемлемой составляющей жизнедеятельности клетки. Массовое исследование структур белков во второй половине XX столетия определило собой революционный прорыв в понимании функционирования живых организмов на микроуровне и дало человечеству множество медицинских и биохимических приложений.

В качестве мономеров в белках используются остатки аминокислот. Все животные и растительные белки состоят из двадцати аминокислот. Степень полимеризации может изменяться от десятков (пептиды) до нескольких тысяч, а оценки количества различных белков, существующих в природе, составляют миллиарды. Различают четыре уровня организации строения белков. Первичная структура определяется последовательностью аминокислот в белке. Вторичная структура белка (а-спираль или Р-структура) определяется видом мономерной цепочки (полипептидной цепи) в пространстве. Вторичная структура, в свою очередь, подвергается специфическому для каждого белка сворачиванию (фолдингу), определяющему третичную структуру белка и делающему белок компактным монодисперсным объектом. Наконец, сложные белки могут состоять из нескольких полипептидных цепей, а также различные участки одной полипептидной цепи могут образовывать отдельные пространственные субединицы, что определяет четвертичную структуру белка.

В начале 80-х годов прошлого столетия после того, как с помощью рентген о структурного анализа были определены пространственные структуры некоторых белков, обнаружилось, что белки, будучи полимерами, проявляют в своей организации так называемые фрактальные свойства. В это время в физике полимеров широкое развитие получили идеи самоподобия или масштабной инвариантности [2, 3]. Развитие теории критических явлений [4, 5] в приложении к полимерам позволило описать многочисленные степенные зависимости в термодинамике полимерных цепей, что привело к определению семейства экспонент, характеризующих полимерные системы. Появившееся понятие фрактальной (дробной) размерности [6] стало активно использоваться как одна из фундаментальных структурных характеристик, с помощью которой определялась взаимосвязь между вышеупомянутыми экспонентами. Следует отметить, что структуры, обладающие фрактальной размерностью (фракталы), широко исследовались и в других областях физики, включая гидродинамику, статистическую физику, астрофизику и др. (см. [6,7, 8, 9, 10]). В качестве примеров фрактальных структур можно упомянуть линейные и ветвящиеся полимеры и эпоксидные смолы [11, 12], пористые материалы и материалы с развитой поверхностью [13, 14], дендриты — агрегаты, возникающие при реакциях, управляемых диффузией [15, 16] и др.

В отличие от обычных полимеров, структура и поведение белков в растворе носит более сложный характер. В дополнение к термодинамическим свойствам полимеров в растворе белки удовлетворяют ряду специфических требований. Например, для белков-катализаторов химических реакций, ферментов, — это определенные третичная и четвертичная структуры, обеспечивающие перемещение связываемых химических комплексов (лигандов) и их взаимодействие с так называемыми активными центрами в ферменте. Для связывающих белков специфичный фолдинг должен обеспечивать требуемый контакт с другими биополимерами (субстратами). Тем не менее белки, являясь полимерами в растворе, проявляют в той или иной мере фрактальные свойства. При этом возникает вопрос, насколько эти свойства специфичны для данного белка или семейства белков, или, другими словами, существует ли связь между фрактальными характеристиками структуры белков и их функциональными свойствами, такими как распознавание и избирательность при взаимодействии с другими объектами, а также насколько эти характеристики существенны при описании физических и химических свойств белков?

Настоящая работа посвящена исследованию фрактальных свойств поверхности белков. Проявление фрактальных свойств в структуре белковой поверхности активно изучается в последние 15 лет [17, 18]. Интерес к этому вопросу обусловлен, прежде всего, тем, что все взаимодействия белков друг с другом и с другими объектами происходят посредством контакта, т. е. через поверхность. Поэтому естественно предположение о том, что характеристики поверхности могут значительно влиять на такого рода взаимодействия. Полученные до сих пор результаты приводят порой к противоречивым выводам как о степени проявления фрактальных свойств в структуре белковой поверхности, так и об их соответствии каким-либо свойствам белков. Тем не менее, тот факт, что белковая поверхность обладает фрактальной структурой, является общепризнанным. Следует отметить, что, благодаря появлению большого количества белковых структур, определенных с помощью кристаллографического анализа, стало возможным более детальное и тщательное исследование вопроса фрактальности белковой поверхности. В частности, количества кристаллографических данных на сегодняшний день (более 10 ООО структур) достаточно, чтобы проводить изучение поверхностей для белковых семейств, связанных какими-либо общими функциональными или структурными свойствами.

Целями настоящей работы являлось:

1) Изучение и сравнение фрактальных свойств поверхности белков при различном пространственном разрешении для ряда белковых семейств;

2) Развитие методики нейтронного малоуглового рассеяния для изучения фрактальных свойств поверхности белков в растворе.

В первом случае использовались кристаллографические данные высокого пространственного разрешения, полученные с помощью дифракции рентгеновских лучей и собранные в так называемом банке белковых структур (Protein Data Bank, PDB) [19]. Основная идея исследований касалась вопроса о том, как изменяется зависимость площади поверхности белка от его объема при различном разрешении для различных семейств. Фрактальные характеристики поверхности сильно влияют на такую зависимость, и при некоторых ограничениях по ней можно оценить фрактальную размерность поверхности, что и осуществляется в настоящей работе.

Во втором случае ставилась задача о том, насколько точно можно определить фрактальную размерность поверхности белков в растворе по данным малоуглового рассеяния нейтронов, а также насколько сильно данные о фрактальной структуре поверхности белков в кристалле отличаются от таковых для белков в растворе. Использование нейтронов обусловлено возможностью широкой вариации рассеивающей плотности белков с использованием замещения водород/дейтерий как в растворителе (смеси H2O/D2O), так и внутри исследуемого объекта (дейтерирование белка). Для получения кривой рассеяния от формы белка использовался метод тройного изотопического замещения [20,21].

В главе 1 собраны сведения, относящиеся к общим вопросам определения, построения и анализа молекулярной поверхности белков. В ней описываются методы построения и аппроксимации молекулярной поверхности, а также методы оценки ее параметров. В частности, обсуждается возможность использования четырехточечных проективных фильтров [22], изучавшихся автором [23] в одномерном случае, при аппроксимации молекулярной поверхности сплайнами. На основе качественного сравнения обуславливается выбор методов построения и аппроксимации молекулярной поверхности, используемых в настоящей работе.

В главе 2 представлены некоторые аспекты теории фракталов. Основной целью в главе поставлено выделение и классификация главных понятий, определений и методов, используемых в настоящей работе. Вместе с основными определениями даны общие способы оценки фрактальной размерности, которые дополнительно обсуждаются в применении к фрактальным поверхностям. Подробно освещен вопрос применения малоуглового рассеяния для определения размерности фрактальных структур. При изучении данного вопроса автор принимал участие в исследованиях различных фрактальных систем, в частности алюмосиликатных аэрои ксерогелей [24] и гуминовых кислот [25−27]. Основные результаты этих исследований, касающиеся фрактальной структуры данных систем, приведены в настоящей главе. Также представлен литературный обзор исследований фрактальных свойств молекулярной поверхности белков.

Глава 3 посвящена результатам исследования фрактальных свойств поверхности пяти белковых семейств на основе работ автора [28−30]. В частности, приведены данные анализа поверхности белков этих семейств при различном пространственном разрешении, на основе которых развивается и обсуждается концепция двухуровневой организации белковой поверхности и ее связь с фрактальной структурой полипептидной цепи белков.

В главе 4 представлены результаты эксперимента по малоугловому рассеянию нейтронов с использованием тройного изотопического замещения на белке фактор элонгации Ти (ЕР-Ти). Описаны методы изоморфного замещения в малоугловом нейтронном рассеянии на основе замещения дейтерий/водород и обусловлен выбор метода тройного изотопического замещения. На основе экспериментальных данных сделана оценка фрактальной размерности поверхности белка. Проведено сравнение экспериментальных данных с результатами моделирования кривых рассеяния по кристаллографическим данным высокого разрешения. Исследованы границы применимости метода тройного изотопического замещения при определении фрактальной размерности поверхности белков. Результаты этой главы опубликованы в работе [31].

Заключение

.

1. Предложена методика исследования поверхности белков, построенной по кристаллографическим данным высокого разрешения. Эта методика позволяет проводить изучение поверхности белковых семейств при различном разрешении, выявляя влияния формы, асимметрии, крупных и мелких неоднородностей на структуру поверхности.

2. На основе анализа фрактальных свойств поверхности различного разрешения для белковых семейств, включая глобулярные белки, ДНК-связывающие белки, однодоменные и двудоменные тРНК-связывающие белки, а также домены двудоменных тРНК-связывающих белков, показано, что белковая поверхность проявляет двухуровневую организацию. Макро- (неоднородности больше 10 А) и микро- (неоднородности меньше 10 А) уровни поверхности обладают разными фрактальными размерностями.

3. Установлено, что фрактальная организация микроуровня белковой поверхности одинакова для всех белков, независимо от их принадлежности тому или другому семейству. Оценки фрактальной размерности микроуровня колеблются около 2.1.

4. Показано, что макроуровень поверхности белков проявляет заметные различия для разных белковых семейств. Его фрактальная размерность больше 2.2 и в случае ДНК-связывающих белков достигает 2.8(2). Возможным параметром соответствия с фрактальной размерностью макроуровня является относительная площадь взаимодействия белка с субстратом.

5. С помощью метода малоуглового рассеяния нейтронов с использованием тройного изотопического замещения определена фрактальная размерность поверхности белка фактор элонгации Ти (ЕЕ-Ти), которая равна 2.66(5) и соответствует макроуровню поверхности белка. На основе сравнения экспериментальной кривой рассеяния ЕЕ-Ти с кривыми, рассчитанными по кристаллографических данным, установлено, что фрактальные структуры макроуровня поверхности белка в растворе и кристалле совпадают.

6. Показано, что с помощью метода тройного изотопического замещения можно получить достаточно точную оценку фрактальной размерности макроуровня белковой поверхности для белков с молекулярной массой больше 10 кДа. Вместе с тем, при больших значениях переданного импульса, q > 0.5 А" 1, соответствующих размерам.

— 10А, на кривую тройного изотопического замещения сильное влияние оказывают корреляции в расположении неполярных атомных групп на уровне вторичной структуры белка.

7. Предложено объяснение двухуровневой организации белковой поверхности на основе связи структуры поверхности с фрактальной структурой полипептидной цепи белка. В рамках этого объяснения фрактальная структура поверхности белка есть результат конкуренции двух свойств белка: компактности и площади взаимодействия. Белок является плотноупакованной системой, а необходимая площадь взаимодействия с другими объектами достигается посредством фрактальной структуры его полипептидной цепи, выходящей на поверхность.